复方金银花外洗液及其单味药的体外透皮实验与抑菌活性研究

黄开远，谢展雄，吴群华，刘宇琳

(深圳市龙华区中心医院 药剂科，深圳 518110)

·基础研究·

复方金银花外洗液及其单味药的体外透皮实验与抑菌活性研究

黄开远*，谢展雄，吴群华，刘宇琳

(深圳市龙华区中心医院 药剂科，深圳 518110)

目的：观察复方金银花外洗液(外洗液)及金银花水提液(金银花液)体外透皮吸收的效果；并探讨两者对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌的体外抑菌活性。方法：采用改良的Franz扩散池装置，以昆明小鼠腹部皮肤为屏障，利用高效液相色谱法研究外洗液及金银花液中绿原酸的透皮吸收性能；采用管碟法测定外洗液及金银花液对4种菌的抑菌能力；用试管二倍稀释法与平板涂布法结合确定药液对4种菌的最小抑菌浓度(MIC)。结果：绿原酸在体外可以通过透皮吸收，外洗液和金银花液在8 h内绿原酸的累积透皮释药量分别为1.68、0.98 μg·cm-2；金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌对外洗液及金银花液均敏感；含相同绿原酸量的外洗液的抑菌圈直径都大于金银花液；含相同质量浓度的绿原酸和生药的外洗液对4种菌的MIC值均比金银花液对4种菌的MIC值小。结论：外洗液及金银花液均有体外透皮吸收作用和抑菌活性，且复方的最高安全剂量和功效要强于单味药。

金银花；外洗液；抑菌效果；透皮吸收

湿疹、疥癣是皮肤科中常见的疾病，对于真菌感染引起的湿疹、疥癣临床中主要使用抗菌药和激素治疗，由于微生物的耐药性越来越严重，单纯依靠抗菌药和激素的治疗方案对于某些病例已经起不到满意的治疗效果。因此，合理开发、利用中草药，特别是对具有抗菌活性的中药复方的研究具有重要意义[1]。复方金银花外洗液是我院在复方黄柏液的基础上加减而成，由金银花(15 g)、苦参(15 g)、黄柏(6 g)、蛇床子(12 g)、土茯苓(12 g)5味药组成。具有清热解毒、燥湿止痒、抗真菌的功效，临床实践中主要应用于因真菌感染引起的疥癣、脚痒及足部湿疹等疾病。金银花为忍冬科忍冬属植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花或花蕾，具有清热解毒、凉风散热、抗炎、抑菌和增强机体免疫功能等作用[2-3]。金银花在临床中经常外洗或外敷应用于湿疹及过敏性皮肤瘙痒，对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌有较好的抑制作用，但是对绿脓杆菌及其他菌抑制作用不明显。因此本研究以复方金银花外洗液及其单味药金银花水提液进行体外透皮吸收与抑菌活性的实验研究比较，为复方金银花外洗液的临床应用提供理论依据，同时也为中药复方的应用提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 药物

金银花、苦参、蛇床子、黄柏、土茯苓(广东康美药业有限公司，批号分别为150101、150501、150801、150801、151002)；绿原酸(中国食品药品检定研究院，批号：110753-201415)。

1.2 动物

SPF级昆明种小鼠，6～8周龄，体质量(20±2)g，雄性，由广州中医药大学实验动物中心提供。动物批准文号：SCXK(粤)2014-0001。金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌[中国食品药品检定研究院，批号分别为CMCC(B)26003、CMCC(B)63501、 CMCC(B)44102、CMCC(B)10104]。

1.3 试剂

乙腈、甲醇(Merck公司)为色谱纯，其他试剂均为国产分析纯；营养琼脂(杭州天和微生物试剂有限公司)。

1.4 仪器

AB16UU型CO2培养箱(德国Heraeus公司)；XDS-1B型倒置显微镜(重庆光电公司)；高效液相色谱仪LC-20AT(日本岛津)；二极管阵列检测器；YB-P6智能透皮试验仪(天津药典标准仪器厂)；AUW220分析天平(日本岛津)；其他均为常用仪器。

2 方法

2.1 外洗液及金银花液的制备

准确称取处方量为150 g的外洗液中药(含金银花37.5 g)和50 g金银花加蒸馏水各自提取两次，比例为1∶12、1∶8，第一次60 min、第二次40 min，将外洗液和金银花提取液浓缩成1.0 g·mL-1装于三角瓶中煮沸30 min，灭菌后储存于4 ℃冰箱备用。

2.2 高效液相色谱测定方法

2.2.1 色谱条件 安捷伦TC-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，4.6 μm)；流动相：乙腈-0.4%磷酸缓冲盐溶液(11∶89)；检测波长：327 nm；流速：1 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取绿原酸对照品适量，加50%甲醇制成1 mL含绿原酸0.048 0 mg的溶液，即可。

2.2.3 样品溶液制备 精密吸取2.1项下的外洗液500 μL置25 mL棕色瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀；再从棕色瓶中吸取500 μL置25 mL棕色瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；金银花液的制备方法同外洗液。

2.2.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液用50%甲醇稀释成0.096、0.96、4.8、9.6、24.0 μg·mL-1，进样20 μL测定，以绿原酸的峰面积(Y)和浓度(X)进行线性回归，求得标准曲线的回归方程为Y=58 995X+2 084.2，r=0.999，结果表明绿原酸在0.096～24.0 μg·mL-1有良好的线性关系。

2.2.5 精密度试验 精密吸取2.2.2项下对照品溶液20 μL，重复进样6次，RSD=1.13%。

2.2.6 稳定性试验 取透皮接收液在室温下放置，分别于0、1、4、8 h进样测定绿原酸峰面积，结果RSD=0.42%，表明接收液在8 h内稳定。

2.2.7 样品绿原酸的含量测定 吸取2.2.3项下的样品用0.45 μm 滤膜过滤，进样20 μL，在327 nm处测定绿原酸的峰面积，代入标准曲线方程，得外洗液和金银花液中绿原酸的质量浓度分别为6.4、22.3 μg·mL-1。

2.3 体外透皮吸收方法

2.3.1 离体鼠皮的制备 昆明小鼠脱颈处死，手术剥离腹部去毛皮肤，并清除皮下黏膜和脂肪组织，用0.9%氯化钠溶液冲洗干净，置于-20 ℃冰箱保存。

2.3.2 体外透皮实验装置及方法 本实验采用YB-P6智能透皮试验仪，将预处理皮肤从-20 ℃冰箱中取出，自然解冻，用滤纸吸干皮肤表面0.9%氯化钠溶液备用。皮肤置于扩散室与接收室之间，角质层朝向扩散室，用铁夹固定，剪去多余的皮肤，扩散室和接收室之间的半径0.8 cm，渗透面积为2.01 cm2，向接收室加入 17.0 mL接收液[0.9%氯化钠溶液-乙醇(7∶3)][4]，排出气泡，在供药室中分别加入含生药量相同的外洗液和金银花液2 mL(外洗液含12.8 μg绿原酸，金银花液含44.6 μg绿原酸)，开动电磁搅拌器(300 r·min-1)，32.5 ℃恒温，分别于1、2、3、4、6、8 h从接收池取样1 mL，同时向接收池中补充等量同温的接收液并排除气泡。

2.3.3 计算累积透皮量 取接收液1 mL用0.45 μm 滤膜过滤，进样 20 μL，测定绿原酸的峰面积，代入标准曲线方程，得接收液浓度，并按文献计算累积透皮量Q(μg·cm-2)[5]。

(1)

式中：Cn—第n个取样点测得的药物浓度(μg·mL-1)；

V—接收池体积；

Ci—第I个取样点测得的药物浓度(μg·mL-1)；

V0—取样体积；

A—渗透面积(cm2)，Franz的扩散池面积为2.01 cm2。

2.4 体外抑菌试验方法

2.4.1 菌悬液的制备 分别将金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌接种于营养琼脂培养基斜面，37 ℃培养24 h，然后用无菌水冲洗，配成含菌数约为1×108～2×108cfu·mL-1的菌悬液待用。

2.4.2 外洗液及金银花液对不同菌株的体外抑菌试验 采用管碟法，取肉汤琼脂培养基20 mL倒入内径90 mm的无菌玻璃平皿内，使培养基水平均匀地铺在平皿内；吸取被检菌液1 mL与冷至45 ℃的肉汤琼脂培养基5 mL混匀，均匀摊布在底层培养基上，即得双层琼脂平板[6]。待表面干燥后，用无菌镊子夹取已经高压蒸气消毒并烘干的牛津杯，轻轻平置于菌液平板表面，每皿呈三角形放3只牛津杯，分别取2.1项下的外洗液和金银花液适量并用无菌水稀释至0.5 mL，分别加入牛津杯中，每种水平加3孔作为平行样，同时设无菌0.9%氯化钠溶液为空白对照。置于恒温培养箱中37 ℃条件下培养24 h，观察并测量抑菌圈直径大小。抑菌圈直径小于10 mm为耐药，10～15 mm为低度敏感，15～20 mm为中度敏感，20 mm以上为高度敏感。

2.4.3 药物最小抑菌浓度(MIC) 的测定 采用试管二倍稀释法，取10只无菌具塞试管，编号排列在试管架上，于每管先加入无菌肉汤培养基2 mL，然后于第1管中加入已经混匀的灭菌外洗液或金银花液2 mL (内含外洗液1892 μL或金银花液544 μL)，混匀后取出含药培养基2 mL放入第2管中，依此类推，直到第8管取出2.0 mL弃去。第9管不加药物作为阳性对照，以便观察培养基是否适合细菌生长。第10管加药液2.0 mL混匀后取出2.0 mL弃去，不加细菌作为阴性对照，以便观察外洗液是否受污染。每管平行3份。分别取菌液100 μL，加入1～9号试管中，使每管最终菌液浓度约为5×105cfu·mL-1，混匀后一起放入37 ℃培养箱中培养24 h观察结果。记录各管内细菌生长情况，以浑浊度为指标检查试管中有无细菌生长，眼观选出澄清透明无细菌生长的各管，分别取其液体涂布于琼脂平板培养基上，恒温培养箱培养24 h，观察琼脂平板上无细菌生长而含药液浓度最低者，即为该种药物对该菌株的最低抑菌浓度(MIC)。

2.5 统计学分析

3 结果

3.1 绿原酸色谱峰的分离鉴定

绿原酸的色谱分离结果如图1所示，与对照品绿原酸的色谱峰(见图1B)相比，接收液(见图1A)在绿原酸的保留时间处没有杂峰出现，同时外洗液接收液和金银花液接收液(见图1C和1D)的色谱峰峰形良好，表明色谱条件可以对绿原酸进行很好分离，而且接收液对绿原酸的测定无干扰。

3.2 外洗液和金银花液对绿原酸透皮吸收的影响

将检测结果代入公式计算累积透皮量，制作渗透曲线。外洗液和金银花液在每个时间段的接收液中均可以检测到绿原酸。外洗液和金银花液在8 h时内对绿原酸的累积透皮量分别为1.68、0.98 μg·cm-2(以绿原酸计，下同)，表明外洗液中绿原酸的透皮吸收的作用要强于金银花液，通过绿原酸透皮累积释药时间曲线(见图2)可以看出，外洗液中绿原酸的累积透皮量在每个时间段内明显大于金银花液，这可能是复方金银花外洗液经处方配伍后金银花中主要成分绿原酸的经皮渗透效果优于其单味的金银花提取液。

注：A.接收液；B.绿原酸对照品；C.外洗液；D.金银花液。图1 复方金银花外洗液及对照溶液的HPLC图

图2 外洗液及金银花液中绿原酸透皮累积 释药时间曲线

3.3 外洗液及金银花液对4种菌株的抑菌效果

外洗液及金银花液不同药物含量对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌都有不同程度的抑制作用，其中金黄色葡萄球菌和大肠杆菌对外洗液和金银花液不同药物含量高度敏感，且剂量与抑菌圈的直径呈正比；枯草芽孢杆菌和绿脓杆菌对两种提取液分别具有中度敏感和低度敏感，但随着用药剂量的增加，抑菌圈直径变化不大；通过比较表1和表2的数据可以得出：含相同量绿原酸(0.757 μg，外洗液生药量为118 mg，金银花液生药量为34 mg)的外洗液对4种菌的抑菌圈直径都要大于金银花液的抑菌圈直径，说明复方中其他的生药也发挥抑菌作用，同时根据含相同生药量的数据(18 mg外洗液含金银花的量为4.5 mg、绿原酸的量为0.114 μg，17 mg金银花液中含金银花的量为17 mg、绿原酸的量为0.375 μg)说明在含相同生药量的情况下，复方中4.5 mg的金银花便可达到17 mg金银花的抑菌效果。综上所述外洗液中各味药相须为用，从而减少了复方中金银花的用量，使复方的外洗液治疗效果要优于单味的金银花。

3.4 外洗液和金银花液的最小抑菌浓度(MIC)的测定结果

外洗液实验中作为阳性对照试管内的菌株生长良好，说明培养基适合细菌生长。作为阴性对照试管内的液体澄清透明，说明外洗液未受污染。通过表3和表4可知，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌：外洗液的MIC值为7.4 mg·mL-1(生药量)和0.047 μg·mL-1(绿原酸)，金银花液的MIC值为8.5 mg·mL-1(生药量)和0.189 μg·mL-1(绿原酸)；绿脓杆菌：外洗液的MIC值为14.8 mg·mL-1(生药量)和0.094 μg·mL-1(绿原酸)，金银花液的MIC值为34 mg·mL-1(生药量)和0.757 μg·mL-1(绿原酸)；枯草芽孢杆菌：外洗液的MIC值为29.6 mg·mL-1(生药量)和0.189 μg·mL-1(绿原酸)，金银花液的MIC值为34 mg·mL-1(生药量)和0.757 μg·mL-1(绿原酸)。综合数据分析可知：外洗液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌有较显著的抑菌作用，同时对枯草芽孢杆菌也有抑制作用，这与外洗液在临床上有较好的燥湿止痒、抑菌的功效相一致。金银花液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC值为0.189 μg·mL-1，对枯草芽孢杆菌和绿脓杆菌的MIC值为0.757 μg·mL-1。在含等量的绿原酸的情况下，单味的金银花提取液对4种菌的抑菌效果都要弱于复方金银花外洗液，同时在含等量的生药量情况下，单味的金银花提取液对4种菌的抑菌效果也都要弱于复方金银花外洗液，这可能是外洗液中含有土茯苓、苦参、蛇床子等对这4种菌株产生联合的抑制作用，说明外洗液中各味药相须为用从而增强复方的治疗效果。具体结果见表3、表4。

表1 外洗液不同药物含量对4种菌株的抑制作用

表2 金银花液不同药物含量对4种菌株的抑制作用

表3 外洗液对不同菌株的最小抑菌浓度(n=3)

4 讨论

本研究的体外透皮吸收实验采用的是离体的雄性昆明小鼠的腹部皮肤作为药物渗透屏障，同时采用高效液相色谱法测定绿原酸的累积透皮量，保证了结果数据的可靠性与准确性[7]。本实验结果显示：外洗液中绿原酸透皮吸收的作用要强于金银花液，同时外洗液中绿原酸的累积透皮量在每个时间段内明显大于金银花液。这可能是外洗液中含有苦参、蛇床子、土茯苓等其他药物，使外洗液中绿原酸的渗透作用比单味药有显著提高，这也是中药挥发油常被作为透皮吸收促进剂的原因[8]。外洗液中绿原酸的渗透效果要强于单味的金银花液，可能就是外洗液中含有促进绿原酸透皮吸收的挥发油，但究竟是外洗液中的何种成分促进绿原酸的透皮吸收有待下一步深入研究。

本实验选用复方金银花外洗液及其单味药金银花提取液对常见的4种致病菌进行体外抑菌实验的研究，在测定药物最小抑菌浓度(MIC) 时采用的是试管二倍稀释法，由于中草药的提取液大部分具有颜色，对抑菌试验的结果判定会产生一定的影响，因此本试验对MIC的测定方法做了相应的改进，首先眼观选出澄清透明无细菌生长的试管，再将试管内的液体吸出，分别取其液体涂布于琼脂平板培养基上，于恒温培养箱培养 24 h，观察琼脂平板上有无细菌生长从而判定药物对该菌株的最小抑菌浓度[9]。外洗液及其金银花液对4种菌株的抑菌效果和最小抑菌浓度的实验结果显示出其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都有较好的抑制作用，这佐证了外洗液及其金银花液在临床上常用于湿疹、疥癣治疗的理论依据[10]。在含相同质量浓度绿原酸的剂量下，外洗液的生药量要大于金银花液，但外洗液中金银花的含量要少于金银花的含量。外洗液对于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌抑菌能力比金银花液对这4种菌株的抑菌能力强，在一定程度上说明了中药复方的功效要比单味药强。这可能是复方金银花外洗液中含有燥湿止痒、抗菌功效的苦参、黄柏、蛇床子、土茯苓，各味药相须为用从而增强复方的治疗效果；同时也说明含相似功效的中药联用可以减少单味药的剂量。因此在临床上应多用复方的金银花液，不仅可以增强各味药的疗效，同时可以减少单味药的剂量和降低细菌对单味药的耐药性。

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InvitroAntibacteriostaticActivityandPercutaneousAbsorptionfromFlosLoniceraeJaponicaeLotionanditsWaterExtract

HUANGKaiyuan*，XIEZhanxiong，WUQunhua，LIUYulin

(PharmacyofShenzhenLonghuaDistrictCentralHospital，Shenzhen518110，China)

Objective：To detect the bacteriostatic activity of Flos Lonicerae Japonicae lotion and its water extract onStaphylococcusaureus，Bacillusstubtilis，EscherichiacoliandPseudomonasaeruginosainvitro.Methods：The minimum inhibitory concentration (MIC) was scaled by tube dilution and plate smearing methods.The percutaneous absorption potential of their chlorogenic acid were detected by HPLC，in which via mouse’s abdominal skin cell viability was determined using Flos Lonicerae Japonicae lotion and its water extract to the four bacteria.Results： Chlorogenic acid could be absorbed via skininvitro，so after 8 hours treatments of the Flos Lonicerae Japonicae lotion and its water extract，the chlorogenic acids’ amount were 1.68 and 0.98 μg·cm-2，respectively.Staphylococcusaureus，Bacillusstubtilis，EscherichiacoliandPseudomonasaeruginosawere sensitive to Flos Lonicerae Japonicae lotion and its water extract.Meanwhile，the inhibition zone diameter of Flos Lonicerae Japonicae lotion was bigger than that of its water extract，but the lotion’s MIC was less than water extract’s.Conclusion： Both Flos Lonicerae Japonicae lotion and its water extract can be used as antibiotic treatment and absorbed via skin in vitro.Moreover，the effect of compound of Flos Lonicerae Japonicae was better than individual drug.

Flos Lonicerae Japonicae；topical washing liquid；anti-bacterial effect；percutaneous absorption

] 黄开远，中药师，硕士，研究方向：临床药学；E-mail 404665355@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.6.013

2016-07-13)

*[