基于MT3、SOD2 mRNA表达调控的醒脑再造胶囊抗脑缺血再灌注损伤作用

李向阳，姚永琴，吴光泽，徐庆锋，吴 芹，石京山

(1.商丘医学高等专科学校 药理学教研室，河南 商丘 476005；2.遵义医学院 基础药理学教育部重点实验室，贵州 遵义 563099)

基础医学研究

基于MT3、SOD2mRNA表达调控的醒脑再造胶囊抗脑缺血再灌注损伤作用

李向阳1,2，姚永琴1，吴光泽2，徐庆锋2，吴 芹2，石京山2

(1.商丘医学高等专科学校 药理学教研室，河南 商丘 476005；2.遵义医学院 基础药理学教育部重点实验室，贵州 遵义 563099)

目的观察醒脑再造胶囊的抗脑缺血再灌注损伤作用并探讨其作用机制。方法灌胃给药醒脑再造胶囊1周后，建立SD大鼠大脑中动脉缺血2 h再灌注24 h模型，进行大鼠神经功能评分，2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色法观察脑组织梗死范围，实时荧光定量PCR检测脑组织缺血半暗带区域金属硫蛋白3(MT3)和超氧化物歧化酶2(SOD2)mRNA的表达。结果醒脑再造胶囊预处理可明显降低大鼠脑缺血再灌注损伤后神经功能评分，缩小脑组织梗死范围，并使脑组织缺血半暗带区域MT3和SOD2mRNA的表达显著增加。结论醒脑再造胶囊抗大鼠脑缺血再灌注损伤作用与上调脑组织抗氧化损伤基因MT3和SOD2mRNA的表达有关。

脑缺血再灌注损伤；金属硫蛋白3；超氧化物歧化酶2；氧化损伤；SD大鼠

缺血性脑卒中具有高发病率、高病死率、高致残率和高复发率的特点[1-2]，脑组织缺血后的血流恢复有可能导致其结构和功能的进一步损伤，这种情况称为脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)，减轻CIRI已成为目前治疗缺血性脑卒中的关键环节。

醒脑再造胶囊由石菖蒲、胆南星、僵蚕、冰片、石决明、珍珠、地龙、天麻、猪牙皂、细辛和红花组成，具有益气活血、化痰醒脑、祛风活络之功效，用于神志不清、语言蹇涩、口角流涎、肾虚痿痹、筋骨酸痛、手足拘挛、半身不遂及脑血栓形成的恢复期和后遗症的治疗[3]，但其疗效的具体作用机制不清。本实验观察了醒脑再造胶囊对CIRI大鼠模型的效应并在基因水平进行了作用机制探讨。

1 材料与方法

1.1 仪器和试药 Master-cycler Gradient PCR仪(德国Eppendorf 公司)；iCycler iQReal-Time PCR 仪(美国Bio-Rad)；MACO栓线(北京西浓科技有限公司)；醒脑再造胶囊(XNZZ，中美华医河北制药有限公司，国药准字：Z13020394，批号：150702)；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC，北京索莱宝科技有限公司)；RNA 提取及逆转录反应系列试剂盒及β肌动蛋白(β-actin)、金属硫蛋白3(MT3)和超氧化物歧化酶2(SOD2)基因引物[大连宝生物(TaKaRa)工程有限公司，见表1]；SYBR® GREEN PCR Master Mix(ABI公司)。

1.2 实验动物 健康♂SD大鼠[第三军医大学大坪医院实验动物中心，生产许可证号：SCXK(渝)2012-0005，清洁级]，10周龄，体重250～270 g。

表1实时荧光定量PCR检测基因扩增引物的序列

基因基因编号 上游引物(5'—3') 下游引物(3'—5')β-actinNM_031144TCTTCCAGCCTTCCTTCCTGCACACAGAGTACTTGCGCTCMT3NM_053968CCCTGTCCTACTGGTGGTTCTTGGCACACTTCTCACATCCSOD2NM_017051TCTGTGGGAGTCCAAGGTTCCAGTGGAATAAGGCCTGTGG

1.3 实验分组、制模 将60只健康♂SD大鼠随机均分为假手术组(sham)、模型组(model)、XNZZ低剂量组(LXNZZ)、中剂量组(MXNZZ)、高剂量组(HXNZZ)。经一周适应性饲养后，将动物称重，计算给药量，每天上午ig给药一次，XNZZ低、中、高剂量组分别按0.5、1、2 g/kg给药，假手术组和模型组均给予相应体积的生理盐水，给药时间持续1周。给药结束的当天下午各组大鼠禁食、自由饮水。第2天用7%水合氯醛(0.5 ml/100g)对各给药组大鼠ip麻醉后颈部备皮，仰卧位固定，消毒皮肤，做颈部正中切口，分离、暴露右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，用动脉夹夹住颈总动脉并结扎颈外动脉，于颈总动脉分叉处切口向颈内动脉插入MACO栓线约(18.5±0.5)mm，至大脑中动脉起始部位出现明显阻力感以完全阻断血流，然后松开动脉夹，并结扎颈内动脉，术后缝合伤口，2 h后拔出尼龙线，即造成大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型。假手术组不插入尼龙线和结扎血管，其他操作步骤同上。

1.4 神经功能评分 缺血2 h再灌注24 h后参照Bederson法[4]对实验动物进行神经功能评分：0分为无任何症状或仅有同侧眼裂缩小；1分为提尾时对侧肢体屈曲内收；2分为抗侧方推力减弱；3分为爬行时向对侧划圈；4分为意识丧失且不能行走。

1.5 脑组织TTC染色及实时荧光定量PCR检测 制模结束后于每组中随机取6只大鼠进行TTC染色。将大鼠麻醉后断头取脑，去除嗅球，小脑和低位脑干后，将脑于-20℃冰箱10min冻至半硬状后，沿冠状面平均切成5片，避光放置于1% 的TTC 溶液中(37℃约15min)染色，然后放入10%多聚甲醛溶液中过夜固定，第二天用滤纸吸干脑片表面溶液后拍照，经染色后，正常脑组织呈玫瑰红色，而梗死组织呈白色且界限分明；脑组织梗死体积比=苍白区重量/(苍白区重量+非苍白区重量)。制模结束后于每组中随机取6只大鼠采用实时荧光定量PCR检测脑组织缺血半暗带区域MT3和SOD2mRNA的表达，将大鼠麻醉后断头取脑，按Trizol法提取脑组织总RNA，紫外分光光度计检测A260/A280在1.8～2.0。按照逆转录试剂盒说明将其逆转录为cDNA并稀释，进行聚合酶链反应。以β-actin为参照，用相对量法计算MT3和SOD2mRNA的表达水平。以Ct值为统计参数，用目的基因表达/β-actin基因表达，对MT3和SOD2mRNA进行相对定量。

2 结果

2.1 醒脑再造胶囊(XNZZ)对大鼠神经功能评分的影响 结果发现与模型组比较，XNZZ低、中、高剂量组可明显降低CIRI动物模型的神经功能评分(见表2)。

2.2 醒脑再造胶囊(XNZZ)对大鼠脑组织梗死范围的影响 结果发现模型组发生明显脑梗死，假手术组未出现脑组织梗死灶，与模型组比较XNZZ低、中、高剂量组脑组织梗死范围均有明显缩小(见图1和表2)。

2.3 醒脑再造胶囊(XNZZ)对大鼠脑组织缺血半暗带区域MT3和SOD2mRNA表达的影响 与模型组比较，XNZZ低、中、高剂量组可明显增加CIRI动物模型脑组织缺血半暗带区域MT3和SOD2mRNA的表达(见表2)。

图1 醒脑再造胶囊对大鼠脑缺血再灌注损伤脑组织梗死范围的影响

表2醒脑再造胶囊对大鼠脑缺血再灌注损伤神经功能评分、脑梗死体积比和MT3、SOD2 mRNA表达的影响(n=6)

组别神经功能评分脑梗死体积比MT3mRNASOD2mRNA假手术002.55±0.65627.20±258.37模型3.28±0.69#0.26±0.07#16.29±4.15971.56±350.26醒脑再造胶囊低剂量2.29±0.70*0.21±0.0225.61±6.60*1523.85±456.34*醒脑再造胶囊中剂量2.14±0.64*0.19±0.02*23.68±5.46*1807.36±643.05*醒脑再造胶囊高剂量1.86±0.63*0.14±0.06*20.36±5.31*2076.43±685.08*

与假手术组比较：#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

3 讨论

脑缺血再灌注损伤是指脑组织缺血一定时间自然恢复血液供应或通过溶栓治疗后恢复血流供应，其功能不但未能恢复，还出现脑水肿、部分受损的脑组织神经元继续死亡或凋亡等更加严重的脑组织损伤，从而进一步加重脑功能的障碍。研究发现，脑组织血流中断和再灌注使脑组织细胞受到损伤是一个快速级联反应，包括细胞中毒、兴奋性氨基酸释放增加、细胞内钙稳态失调、自由基产生、凋亡基因激活等一系列病理生理学过程。这些环节互为因果，彼此重叠，相互联系，形成恶性网络，最终导致脑组织神经元凋亡或坏死[5]。在治疗学上，目前尚无理想的治疗药物，因此继续探索有效的神经保护剂具有重要意义。

MT-3由α和β两个结构域构成，MT-3分布主要限于中枢神经系统，在海马齿状回颗粒细胞、苔状纤维和海马锥状神经元尤为丰富，Ren等发现在MT-3存在情况下，能有效降低体外自由基对皮层和PC12 细胞的毒性，并且其α结构域的潜在抗活性氧能力可能比β结构域强[6]。MT3作为脑组织中的一种特异性生长抑制因子，具有清除自由基、调节脑细胞离子稳态、参与重金属解毒、抗炎症反应和抗细胞凋亡等多种重要生物学功能[7-8]，对脑缺血性应激反应导致的脑组织损伤具有明显保护作用，在脑组织缺血性损伤早期和后期增加MT3的表达均能有效减轻脑组织缺血级联反应所带来的神经损伤[9]；在脑缺血时，细胞色素氧化酶受到抑制，使NADH不能及时氧化而大量存积在细胞内，还原型辅酶Ⅱ(NADPH)能将溶解在生物膜脂质中的氧分子还原，生成超氧阴离子。当恢复血供时，可致氧自由基大量产生。SOD是生物体产生的天然氧化酶，它通过歧化反应清除体内生成的氧自由基，阻断脂质过氧化连锁反应。在脑缺血再灌注后，SOD明显减少，则使氧自由基对脑组织细胞内的脂质、蛋白质和核酸过氧化，导致细胞损伤、死亡[10]。SOD2的重要生理功能表现在它是一种目前所知最有效的氧自由基清除剂之一，具有很强的抗氧化活性，可通过清除氧自由基显著降低脂质过氧化反应，维持线粒体功能稳定，阻遏蛋白质酪氨酸残基亚硝基化，抑制细胞凋亡，减轻缺血性脑组织损伤[11-12]。醒脑再造胶囊具有化痰醒脑、祛风活络、醒脑益智的功能，临床用于中风后遗症和缺血性脑病，但其作用机制尚不完全明了，本实验结果发现，醒脑再造胶囊胶囊0.5、1、2 g/kg预给药1周能够使大脑中动脉缺血2 h再灌注24 h大鼠模型脑组织缺血半暗带区域MT3和SOD2mRNA的表达显著增加。

综上所述，醒脑再造胶囊预处理可以明显降低大鼠CIRI动物模型神经功能评分、缩小脑组织梗死范围，对大鼠CIRI具有保护作用，其作用机制可能与上调脑组织抗氧化损伤基因MT3和SOD2mRNA的表达有关。

[1] 刘敏，方向华.脑卒中后残疾的研究进展[J].中华流行病学杂志，2013，34(11)：1146-1150.

[2] 刘波，丁利静，李菲，等.天麻素对脑缺血再灌注损伤大鼠相关基因mRNA表达的影响[J].遵义医学院学报，2016，39(2)：139-142.

[3] 苗明三，张桂兰，张玉林，等.醒脑再造胶囊对大鼠血瘀性脑缺血模型脑组织的影响[J].中药药理与临床，2007，23(3)：69-70.

[4] Bederson J B，Pitts L H，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery Occlusion：evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke，1986，17(3)：472-476.

[5] 邓江，张洁，罗洁，等.杜仲提取物对脑缺血-再灌注大鼠的保护作用[J].遵义医学院学报，2011，34(5)：484-486.

[6] Ren H,Ji Q,Liu Y,et al.Different protective roles in vitro of alpha-and beta-domains of growth inhibitory factor (GIF) on neuron injuries caused by oxygen free radicals[J].Biochim Biophys Acta,2001,1568(2)：129-134.

[7] Thirumoorthy N,Shyam S A,Manisenthil K K,et al.A review of metallothionein isoforms and their role in pathophysiology[J].World Journal of Surgical Oncology，2011，9(1)：54-61.

[8] Penkowa M.Metallothioneins are multipurpose neuroprotectants during brain pathology[J].Febs Journal，2006，273(9)：1857-1870.

[9] 郭家彬，冯敏，张丽，等.金属硫蛋白在缺血性脑损伤过程中的调控作用[J].中国药理学与毒理学杂志，2014，28(6)：898-903.

[10]Young C,Tenkova T,Dikranian K，et al.Excitotoxic versus apoptotic mechanisms of neuronal cell death in perinatal hypoxia/ischemia[J].Curr Mol Med，2004 ，4(2)：77-85.

[11]袁野，杨俊卿，周岐新.脑缺血/再灌注致小鼠神经元退行性变进程中自由基水平和SOD2表达相关[J].基础医学与临床，2011，31(11)：1229-1233.

[12]戴伟娟，王国芳，林丽文，等.温脾汤提取物对小鼠记忆功能及脑内SOD和MDA的影响[J].中华行为医学与脑科学杂志，2013，22(11)：982-984.

(编辑：谭秀荣)

The protective effects of Xingnaozaizao capsule on cerebral ischemia reperfusion injury based on MT3,SOD2mRNA expressions

Li Xiangyang1,2,Yao Yongqin1,Wu Guangze2,Xv Qingfeng2,Wu Qin2,Shi Jingshan2

(1.Department of Pharmacology,Shangqiu Medical School,Shangqiu Henan 476005,China;2.The Key Laboratory of Basic Pharmacology of Ministry of Education,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

ObjectiveTo observe the protective effects of Xingnaozaizao capsule (XNZZ) on cerebral ischemia reperfusion injury and explore the mechanism.MethodsAfter intragastric administration of XNZZ for 7 days,the SD rat model of cerebral injury was established by 2 h ischemia and 24 h reperfusion.Effects of XNZZ on neurological scale were observed,the infarction volume of brain was detected by TTC staining,and the mRNA expressions of MT3,SOD2were determined by real-time PCR.ResultsXNZZ can obviously reduce the neurological scale,decrease the infarction volume of brain,and increase the mRNA expressions of MT3,SOD2of rats after cerebral ischemia reperfusion injury.ConclusionThe protective effects of XNZZ on cerebral ischemia reperfusion injury would be associated with inducing the activation of the antioxidant genes MT3and SOD2.

cerebral ischemia reperfusion injury;metallothionein 3;superoxide dismutase 2;oxidative damage;SD rats

河南省教育厅高等学校重点科研项目(NO：15B310012)。

吴芹，女，本科，高级实验师，研究方向：基础药理学，E-mail:1258874930@qq.com。

R964

A

1000-2715(2017)04-0394-04

[收稿2017-06-11;修回2017-07-12]