种羊布病虎红平板凝集与竞争ELISA检测的对比分析

刘艳琴 柴贵明 梁莉 刘宗益/内蒙古巴彦淖尔乌拉特中旗农牧业局动物疫病预防控制中心

韩文芳/内蒙古巴彦淖尔市动物疫病预防控制中心

范艳丽 丁博/ 内蒙古巴彦淖尔五原县动物疫病预防控制中心

种羊布病虎红平板凝集与竞争ELISA检测的对比分析

刘艳琴 柴贵明 梁莉 刘宗益/内蒙古巴彦淖尔乌拉特中旗农牧业局动物疫病预防控制中心

韩文芳/内蒙古巴彦淖尔市动物疫病预防控制中心

范艳丽 丁博/ 内蒙古巴彦淖尔五原县动物疫病预防控制中心

布鲁氏菌病（Brucellosis），简称布病，是由布鲁氏菌属（brucellosis）细菌引起人与动物共患的变态反应性传染病，严重地威胁着人类健康和畜牧业经济。历史上，布鲁氏菌病在我国曾经是危害极为严重的人兽共患传染病之一。解放后，布鲁氏菌病的防治得到高度重视，被列为二类法定传染病。

从我国不同年代家畜布病感染状态分析，在上世纪50-60年代家畜感染布病明显高于70-80年代，自70年代后开始下降，80年代末期已下降到有史以来的最低点，90年代初期平均感染率除羊外，牛和猪都达到我国规定的控制标准。布鲁氏菌病的防控始于50年代中期，我国始终重视布鲁氏菌病的防治工作，有组织有计划的进行人畜布鲁氏菌病流行病学调查。然后是60、70年代对高危家畜进行疫苗防治，发病率明显下降，取得了显著成果。

在上世纪50、60年代时乌拉特中旗发生过布病，但由于各级政府及业务部门高度重视布病防治工作，坚持畜间防治以免疫为主，免、检、监测、淘汰阳性畜相结合的综合防控措施，至上世纪90年代，布病基本得到了控制。进入本世纪以后，随着加大农牧业结构调整力度，巴彦淖尔乌拉特中旗旗又是畜牧业大旗，畜牧业地位不断提升，农牧民养殖态度积极，外购牲畜比重逐年增加。由于牲畜购入渠道繁多，流通监管难，导致周边及外来牲畜流入巴彦淖尔乌拉特中旗旗引发布病疫情。

随着当今世界的国际化贸易，布病的检测和监测工作已成为贸易流通中极其重要的一个环节。虽然国际兽医局（OIE）编写了动物传染病的诊断方法及疫苗标准手册已统一各成员国检测方法及结果差异，不同实验室间，即使用同一份血清，由于条件差异或者用不同的方法检测所得结果也会有所差异，在实际检测过程中还有很多问题值得探讨。因为在布病防控工作中，政府要投入大量的人力、财力、物力进行实验室检测、扑杀补贴，因此，选择合理、可靠的检测方法，科学准确的做出结果，才能最终达到有效控制布病的效果，避免在扑杀过程中误杀、漏杀，进而减少农牧民的经济损失。

一、材料和方法

1.种羊。巴彦淖尔乌拉特中旗地区的两个种羊场的115只种羊全部进行监测，所有检测羊均未接种过S19疫苗或口服猪2号疫苗。

2.试剂。布鲁氏菌虎红平板试验抗原，中国兽医药品监察所生产，批号20161003，规格15 ml/瓶，阴性血清，阳性血清。布鲁氏杆菌抗体竞争ELISA检测试剂盒，北京维德维康生物技术有限公司生产，规格96T×2/盒。

3.方法。布鲁菌病抗体检测按照中华人民共和国国家标准（GB/ T18646-2002）操作，布鲁菌抗体检测按照ELISA检测试剂盒的说明书进行操作。采用5 ml一次性采血器，每只羊颈静脉采血2～3 ml，分离血清后进行虎红平板凝集试验(RBPT)。同时将所采血清用竞争ELISA（cELISA）试剂盒进行检测。所有的血清样品用两种方法进行对比检测，以确定RBPT与c-ELISA检测结果的符合率。

二、结果与分析

1.总体情况。

本次实验室共检测血清115头份，RBPT阳性头数46头份，RBPT阳 性 率40%；c-ELISA阳性头数23头份，c-ELISA阳性率20%。

其中种公羊46头份，RBPT阳性血清13头份，布病虎红阳性率28.26%；检测种母羊69头份，RBPT阳性血清33头份，布病虎红阳性率47.83%。

c-ELISA共检测115头份，其中种公羊46头份，c-ELISA阳性血清8头份，布病c-ELISA阳性率17.39%；检测种母羊69头份，结果的符合率为50%，竞争ELISA更准确，RBPT的假阳性率达到50%。种母羊的血清进行RBPT检测时，33份RBPT阳性血清c-ELISA仅确认了15份阳性。试验中发现，这部分羊血清进行RBPT时弱阳性的数量比较多，血清与抗原混合以后3～5min后，才会显现出极细小的颗粒，在进行ELISA确认时测得结果为阴性，RBPT为阳性。从而也表明RBPT受人为判定标准的影响是比较大的，假阳性率较高。

三、讨论与结论

1.血清学诊断是诊断布鲁菌病的主要手段，且血清学诊断方法较c-ELISA阳性血清15头份，布病c-ELISA阳性率21.74%。

2. RBPT与竞争ELISA检测结果比较。

69头份RBPT阴性血清中，竞争ELISA检测阳性数为2，阳性率2.9%，分析有可能是患畜初期感染布病，抗体未达到RBPT检测的含量，RBPT检出阴性；c-ELISA的敏感性高，检出2份阳性血样。RBPT及竞争ELISA检测结果比较见表2。

表1 虎红平板凝集试验（RBPT）及竞争ELISA检测结果

表2 虎红平板凝集试验（RBPT）及竞争ELISA检测结果比较

从整体检测结果看，两种试验多，尤其RBPT是目前我国基层单位群体筛查的主要检测方法。但血清学检测方法存在两个方面问题：一是血清学假阳性反应，原因是由于某些革兰氏阴性细菌感染，如小肠结肠耶尔森0:9，大肠杆菌0：157等，这些细菌表面的脂多糖O链抗原与光滑型布鲁菌表面脂多糖有交叉的抗原结构（C/Y）;二是免疫动物血清中的抗体干扰常规血清学检测，造成误判结果，导致巨大经济损失。研究表明传统的血清学方法和间接ELISA均无法排除假阳性反应，竞争ELISA(c-ELISA)可以排除血假阳性反应。用ELISA检测布鲁菌病是一项新技术，1976年 Cavleson等是最先应用ELISA检测牛布病抗体并发现其敏感性比试管凝集试验高10～100倍。目前世界上比较成熟的检测布病的ELISA方法包括竞争ELISA(cELISA)和间接ELISA（iELISA）两种，iELISA的敏感性较高，cELISA的特异性较高，可以排除其他革兰氏阴性菌引起的假阳性反应。

2.本实验采用的RBPT的优点是易操作、简单，缺点是存在假阳性反应，特异性差，且存在人为判定因素影响 ，本实验结果表明RBPT的假阳性率在50%，这与曹杰，齐长明等人的试验结果40%～50%基本一致。在结果判定时，凡凝集反应缓慢、颗粒细小的，应判为可疑(+)。有实验证明，虎红平板凝集试验、和试管凝集试验这两种诊断方法都会出现较高比例的假阳性和假阴性。

3.由于实验动物数量有限，该实验结果只能初步说明问题，我们下一步将进行大批量动物试验，以期获得更加可靠的数据。虽然说布病检测的血清学方法比较多，但目前还没有一种检测方法是在敏感性、特异性、准确性还是快速简便等方面都兼顾的诊断方法。有结果表明ELISA操作方便，具有较好的敏感性和特异性，建议在检疫中用敏感性较高的RBPT初筛，用特异性较好的ELISA确诊，以得到较好的效果。由于阳性畜的漏检，为扩散蔓延病原提供了条件，阴性畜的误杀又会造成不必要的经济损失，所以大规模检疫时，可以用价格低廉、敏感性强、操作简单的方法先初筛，然后用敏感性、特异性好的诊断方法复检。

（略）