菌毒敌液、强力消毒灵液等六种消毒药以及黄连、甘草、黄柏三种中药不同提取法对实验室空气菌的敏感程度的探究

张正莹,吴 润

（1.甘肃农业大学，甘肃省兰州市730000；2.景泰县畜牧兽医局，甘肃省白银市730400）

菌毒敌液、强力消毒灵液等六种消毒药以及黄连、甘草、黄柏三种中药不同提取法对实验室空气菌的敏感程度的探究

张正莹1,2,吴 润1

（1.甘肃农业大学，甘肃省兰州市730000；2.景泰县畜牧兽医局，甘肃省白银市730400）

为了验证菌毒敌液、强力消毒灵液等六种消毒药以及黄连、甘草、黄柏三种中药不同提取法对实验室空气菌的敏感程度，本实验采用微管-平板法测定了菌毒敌液、强力消毒灵液等六种消毒药以及黄连、甘草、黄柏三种中药不同醇提物和水提物对实验室空气菌的最小抑菌浓度（MIC）,表明消毒药品较中药对实验室细菌的抑制作用效果好，黄连醇提物对实验室细菌的抑制作用明显，甘草、黄柏的水提物对实验菌的抑制作用不明显。综合经济效益和灭菌效果的综合考虑，中药灭菌可值得研究。

醇提物；最小抑菌浓度；水提物；消毒药

早在20世纪50年代我国医药工作者即开始了中药抑菌作用与抑菌成分研究，并发现许多具有抗菌作用的中药。常规的药敏实验方法：有①纸片琼脂扩散法；②试管稀释法；③平板稀释法；④打洞法；⑤挖沟法；⑥微量稀释法等。然而这些方法也存在着其缺陷或局限性，因此我们应根据实际情况选择较合适的方法。试管稀释法是一个比较好的方法，但具有实验工作量大，操作繁琐，一个系列稀释度含药培养基只能测一种菌，营养要求高的菌无法培养等弊端；打洞法同纸片扩散法，存在药物扩散问题，又没有中药标准纸片，实验结果难以控制；平板稀释法只需制两个系列稀释度含药平板，一个稀释度可同时测多种细菌，操作简便，结果准确，是一种比较理想的方法，但是必须注意细菌之间交叉感染的问题；微量稀释法准确可靠，重复性好，且简便易行，但是结果不易观察，加显色剂以后不适用于需要加血的培养基。

根据以往的研究，傅文栋[1]对常见的抗菌抗中草药的主要有效成分进行了列表，对此做出了总结，如金银花为绿原酸、异绿原酸、新绿原酸；黄连为小檗碱、黄连碱、巴马亭。卢芳国[2]等研究了12个中药复方的抗菌作用，发现由麻黄、杏仁、甘草、黄芩、鱼腥草等组成的方剂抑菌效果最为明显。杨勇[3]等对黄连中4种主要的生物碱的抑菌活性进行了研究发现小檗碱的抑菌活性最大，且4种黄连生物碱对G+菌的抑制活性大于G-菌和酵母菌。邬苏晓[4]等人研究发现黄柏抑菌效果较好，MIC为125mg/mL。中草药在其他国家也是有所应用的，WHO曾经做出过这样的估计，全球使用中药的人数占全世界人口的65%-80%。

在中药体外抑菌实验的研究中，一方面证实了其具有抑菌作用，另一方面也试图发现其中的有效抑菌成分。到现在为止，发现有效地抑菌成分很多，而且有很多已经直接或经过改造后投入使用。从20世纪50年代起我国医药工作者开始了对中药抑菌作用与抑菌成分的研究，发现了很多有抗菌作用的中药和其抗菌的主要成分，抗菌成分是很复杂的，它主要包括有生物碱、有机酸、萜类、黄酮、醌类等。

实验部分

1 材料

1.1 药品

名称 生产厂家金碘王（聚维酮碘溶液） 农大润农生物科技有限公司中农卫康消毒剂 哈尔滨中农华大兽药有限公司菌毒敌 湖南大乘医药化工有限公司强力消毒灵 中国农业科学院中兽疫研究所药厂威特格瑞 临洮威特药业有限公司烧碱 浩润化工甘草 景泰县同济大药房黄柏 景泰县同济大药房黄连 景泰县同济大药房

1.2 细菌 实验室空气菌

1.3 试剂

营养琼脂，生产厂家：青岛市高科技园海博生物科技有限公司

革兰氏染液，生产厂家：青岛市高科技园海博生物科技有限公司

普通肉汤培养基，生产厂家：杭州微生物试剂有限公司

1.4 仪器

仪器 型号 生产厂家生物安全柜 BSC-1300IIA2 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司压力蒸汽灭菌器 WG-C35N.L 威海威高生物技术有限公司电热恒温鼓风干燥箱 DHG-9053A上海齐欣科学仪器有限公司电子天平 FA2104N 上海精密科学仪器有限公司超纯水仪 OKP-S010 上海涞科仪器有限公司冰箱 BCD-256DT 青岛海尔股份有限公司电热恒温培养箱DHP-9052上海齐欣科学仪器有限公司

2 方法

2.1 培养基的制备

2.1.1 普通营养琼脂培养基的制备

30g营养琼脂加入1000mL超纯水，高压灭菌121℃，15min。放入生物安全柜，当营养琼脂温度降到55℃左右时浇平板2-3cm厚。待平板内琼脂凝固后，冷藏备用[5]。

2.1.2 普通营养肉汤培养基的制备

30g普通肉汤加入1000mL超纯水，高压灭菌121℃，15min。放入生物安全柜，紫外线消毒降温到室温冷藏备用。

2.2 试验药液的制备

2.2.1 菌毒敌液在生物安全柜内取10mL灭菌超纯水加20uL菌毒敌原液将其作1：500倍稀释到畜禽房舍及器具消毒浓度，冷藏备用。

2.2.2 中农卫康消毒剂 在生物安全柜内取10mL灭菌超纯水加20uL菌毒敌原液将其作1：500倍稀释到畜禽房舍及器具消毒浓度，冷藏备用。

2.2.3 金碘王（聚维酮碘溶液）在生物安全柜内取10mL灭菌超纯水加10uL菌毒敌原液将其作1：1000倍稀释到养殖场常规消毒浓度，冷藏备用。

2.2.4 威特格瑞液 在生物安全柜内取10mL灭菌超纯水加0.01g菌毒敌原液将其作1：1000倍稀释到养殖场常规消毒浓度，冷藏备用。

2.2.5 强力消毒灵液 在生物安全柜内取10mL灭菌超纯水加0.01g菌毒敌原液将其作1：1000倍稀释到饲养场所器具消毒浓度，冷藏备用。

2.2.6 烧碱溶液在生物安全柜内称取0.3g烧碱，加灭菌超纯水10mL将其配成3%消毒浓度，冷藏备用。

2.2.7 醇提取 将黄连、黄柏、甘草粉碎，分别准确称取10g，放入烧杯内，加入 70%乙醇100mL，用超声波提取30min，提取3次，然后加热浓缩，浓缩液放入恒温干燥箱中干燥成药膏，再用蒸馏水溶解配成1g/mL的药液，4℃冰箱保存备用[11]。

2.2.8 水提取 将黄连、黄柏、甘草粉碎，分别准确称取10g，放入锥形瓶中，加入适量的蒸馏水侵泡2-3h，用超声波作用30min，然后用水煎20min，每种药煎2-3次后浓缩成药膏，用蒸馏水稀释到1g/mL的药液，4℃冰箱保存备用[5]。

2.3 菌种的准备

取浇好的一个营养琼脂平板打开放置在实验室，24小时后挑取菌落并用普通营养肉汤做增菌培养，放置恒温培养箱37℃培养18-24h候得原菌液。取试管分别对原菌液用生理盐水进行二倍比稀释，用移液器从8号管中取20μL菌液注入平板上，重复做3个平板，并用L棒将其涂匀，培养18-24h查菌落数，得出原菌液的细菌浓度。将原菌液或稀释后的菌液用生理盐水稀释到所需浓度106cfu/mL[6]，4℃冰箱保存备用。

2.4 各药液对试验菌的最小抑菌浓度（MIC）的测定

在生物安全柜内，采用微管-平板法。每种药物12支EP管，每个EP管内加入500μL的肉汤，向第1支EP管里加入500μL配好的药液，混匀，从中吸取500μL加入第2支EP试管[5]，依次类推，直至第11支试管，弃去500μL，12号EP管做阴性对照。1-12号EP管内加入20μL菌液，37℃培养18-24h后，将其分别接种到平板上[13]，37℃再培养18-24h后，得试验药物对实验菌的MIC[7][8]。

3 试验结果

通过试验[8]，可以得出菌毒敌液、中农卫康消毒剂、金碘王（聚维酮碘溶液）、威特格瑞液、强力消毒灵液和烧碱溶液的最小抑菌浓度的MIC,记录于表2。

药名 MIC（g/mL）菌毒敌液 1/500*8中农卫康消毒剂 1/500*16金碘王（聚维酮碘溶液） 1/500*2威特格瑞液 1/500*128强力消毒灵液 1/500*128烧碱溶液 1/500*256甘草醇提物 1/32甘草水提物 1/8黄连醇提物 1/64黄连水提物 1/16

黄柏醇提物 1/32黄柏水提物 1/8

4 结论

烧碱溶液对试验菌的抑制作用明显，强力消毒灵液和威特格瑞液对实验室细菌的抑制作用相当，对试验菌的抑制作用仅次于烧碱，其它消毒药对某些实验室细菌的抑制作用不明显。其中三种中药的醇提物都比水提物对实验菌的抑制作用强，这三种中药其中黄连醇提物对实验菌的抑制作用最强，黄连和黄柏的水提物对实验菌的抑菌作用较小。此结论为实验室消毒等工作具有指导意义。

[1]傅文栋.中草药及其有效成分体外抗菌抗病毒研究进展[J].中国兽医杂志，2006(5):66-67.

[2]卢芳国,朱应武,田道法.12个中药复方体外抗菌作用的研究[J].湖南中医学院学报,2004,24(4):9.

[3]杨勇,叶小利,李学刚.4种黄连生物碱的抑菌作用[J].时珍国医国药,2007,18(12):3013-3014.

[4]邬苏晓,肖正中,李淑仪等.中草药制剂对猪链球菌和大肠杆菌的体外抑菌效果[J].江苏农业科学,2008,(05):183-184.

[5]王宏军,周铁忠,刘孝刚等.协同指数法筛选银翘天甘组方的最佳剂量配比[J].动物医学进展,2011,32（1）:58-62.

[6]芦亚君,程 宁.3种中药方剂逆转大肠杆菌耐药性的实验观察[J].西北药学杂志,2007,22(6):309.

[7]HyunAeKwon,Yong-JunKwon,Dong-YeulKwon,eta.l Evalua-tion ofantibacterialeffectsofa combination ofCoptidisRhizoma,MumeFructus,and Schizandrae Fructus against Salmonella[J].InternationalJournal ofFoodMicrobiology.2008,127:180.

[8]刘厚,何林,周克元.抗生素敏感试验方法学的研究进展[J].国外医学临床生物化学与检验学分册,2005,26(9):628-634.

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1003-8655（2017）04-0010-03