高效液相色谱-串联质谱法测定人血液中20种毒品的残留量

孙博

广东华生司法鉴定中心

高效液相色谱-串联质谱法测定人血液中20种毒品的残留量

孙博

广东华生司法鉴定中心

目的：试建立高效液相色谱-串联质谱法测定人血液中20种毒品的残留量方法。方法：配制20种毒品的标准储备液，并建立标准曲线。进行血液样本预处理，蛋白用乙腈沉淀离心分离，进行高效液相色谱-串联质谱法测定。结果：建立了20种毒品的Y（色谱峰面积）与x（浓度）的标准曲线，相关系数均大于0.970，线性范围1～100μg/kg，回收率、回收率RSD均符合要求。同时1次性检出样本中的20种毒品残留，无杂峰，无严重干扰。结论：高效液相色谱-串联质谱法可同时测定人血液中多种毒品残留。

毒品；血液检验；残留量；高效液相色谱-串联质谱法

毒品泛滥已成为威胁人类健康以及社会稳定的重要因素之一[1]。近年来，随着化学合成技术的进步，毒品的种类明显增加，纯度提高，给毒品人体残留检测增加了许多困难。随着毒品的泛滥，全世界都加强了口岸吸毒人群的监测，部分地区开始对入境人员进行体内毒品的检测。高效液相色谱-串联质谱法（High perfor⁃mance liquid chromatography-Mass spectrometry,HPLC-MS/MS），是当前最先进的物质成分检测技术之一，结合了色谱以及质谱法两种技术的优势，可同时检测多种物质成分，相较于GC-MS/MS测定方法，样品处理无需衍生，操作相对简单，灵敏度高，国内陆续开展了针对一种或数种毒品HPLC-MS/MS检测体系，检出限、线性范围良好。本次研究尝试构建针对20种毒品残留量高效液相色谱-串联质谱法测定体系。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器：Agilent 1260高效液相色谱串联AB QTRAP 3000四级杆质谱联用仪，IKA MS3涡旋混合器，METTLER TOLEDO电子天平，Milli-Q Reference超纯水纯化系统，氮吹仪，数控超声波清洗器，低温高速离心机，立式透明冷藏箱等。20种毒品标准品，包括苯丙胺、甲基苯丙胺、苯佐卡因，3,4-亚甲基二氧基苯丙胺，咖啡因，氯胺酮，杜冷丁，丁卡因，安定，吗啡，去甲羟基安定，舒乐安定，可待因，利眠宁，咪达唑仑，美沙酮，蒂巴因，四氢大麻酚，三唑仑，氯氮平，由中国国家标准物质中心提供。此外，还包括甲醇、三氯甲烷、环己烷、乙酸乙酯、纯水等标准品。待测样本取自怀疑吸毒人员，10份，采集自肘部外周静脉血。

1.2 方法

1.2.1 标准物质工作液

分别称取以上涉及的20种标准品10.0mg，置于10mL容量瓶中，加入少量甲醇溶解，定容，配制1.0mg/mL溶液，避光保存。称取一定量的毒品标准物质储备液，用甲醇稀释为0.1mg/mL、10μg/ mL、1μg/mL工作液溶液，避光4℃保存。取以上20种毒品标准物质储备液，甲醇稀释，配制浓度分别为0.1μg/mL、0.01μg/mL、1μg/ L溶液，避光4℃保存，制备混合标准物质工作液。

1.2.2 血液处理

空白样品取自无吸毒史的健康人群，抗凝管采集，冷藏保存。取血液1.0mL，置于10mL具塞离心管中，加入5μL 0.2μg/mL的SKF525A内标工作液，加入有机10mL试剂，超声下液液萃取，涡旋混匀器上混匀1min，8000r/min，离心10min，提取上层有机相于试管中，45℃氮气吹干，残留物以100μL甲醇溶液溶解，过0.25μm滤膜，取20μL进样，按仪器工作条件进行测定，测得峰面积，计算回收率。

1.2.3 仪器工作条件

色谱柱：SHIMADZU VP-ODS（250mm×4.6mm，5μm），C18色谱柱，流动相：A：20mmol·L-1醋酸铵溶液（含0.1%甲酸，V/V），B：乙腈（梯度洗脱）。梯度洗脱程序：0～1min，A为90%，1～3min，A由90%降至10%，保持4.5min，7.5min～8min,A升至90%，保持3min。柱温35℃、样品室稳定20℃，1.0 mL·min-1（分流比4:1），进样量20μL。质谱条件：电喷雾离子源（ESI）电喷雾电压2500V，扫描模式为正离子模式（ESI＋），全扫描一级质谱，选择离子二级扫描质谱检查，离子源温度120℃、去溶剂气温度40℃、毛细管电压3.00kV，锥孔电压15V、毛细管电压3V，去溶剂气流速750L·h-1，锥孔反吹气流速50L·h-1。监测的离子对及碰撞能量参照国家标准物质中心提供的标准品质谱分析参数。

1.2.4 定性分析以及检测方法的优化

在获得待测样品中的色谱峰后，根据标准对照品中的保留值，进行定性、改变容量因子K、离线结构分析。符合以下条件则可认为色谱峰与标准对照一致：①色谱峰保留时间与标准样品一致；②峰面积有一定加标比例关系；③符合实验室误差限定标准范围。根据《中华药典》中有关毒品的溶解性，分别考察在10、15、20 min条件下甲醇对药品的溶出度，设计正交试验调节乙腈、水、甲酸、乙酸铵的浓度水平，建立二元溶剂体系，最终发现以乙腈提取的样本的去干扰效果较差，背景干扰多，乙酸乙酯中性条件下回收率较低，加入0.1mol/L NaOH溶液，再提取，化合物回收率较高。原因是多数毒品为有机胺类化合物，在C18柱中的保留性会因为酸性条件下的电离子化而变差，在弱碱性条件下，化合物保留了分子形式，在C18柱上能够得到更良好的保留。为降低样本对质谱仪器的污染，通过在线切换阀处理，将目标化合物出峰前的溶液和待测组分流出色谱柱之后的溶液，切换至废液中，尽量减少各种杂质对质谱的污染。根据对照标准品的裂解方式，选择最高丰度离子作为检测离子条件，最后绘制各类标准品多反应检测总离子流量图。

图1 20种毒品标准品多反应检测总离子流图

2 结果

2.1 毒品的线性方程以及有效性验证结果

精密度试验采用同一份供试品溶液，连续进样6次，相对保留时间RSD（%）在0.1～1.2之间，相对峰面积RSD（%）在0.8～2.9之间，均小于3%，精密度符合要求。

稳定性试验采用同一份供试品溶液，记录0、4、8、16、24h的色谱图，连续进样6次，相对保留时间RSD（%）在0.2～1.1之间，相对峰面积RSD（%）在0.9～2.8之间，均小于3%，样本溶液24h内保持稳定精密度符合要求。

重现性试验：取统一对象的血液样本进行重复检测6次，相对保留时间RSD（%）在0.1～1.2之间，相对峰面积RSD（%）在1.4～2.8之间，均小于3%，重现性良好。

回收率试验，在阴性血液样品中分别加入标准品使其达到1、2、5μg/kg的浓度水平，进行加标回收试验，20种毒品的加标回收率在94～102%之间，符合检测要求。

20种毒品的线性方程、相关系数、检出限，回收率分别如下：①苯丙胺：y=7.50×105＋7.31×105x，0.996，2.0μg/kg，99.5%；②甲基苯丙胺：y=-0.60×106＋2.32×106x，0.994，2.0μg/kg，101.4%；③苯佐卡因：y=-1.56×105＋2.62×105x，0.998，，2.0μg/kg，95.6%；④3，4-亚甲基二氧基苯丙胺：y=3.90×105＋3.39×105x，0.994，2.0μg/kg，98.6%；⑤咖啡因：y=-4.66×104＋5.92×105x，0.999，2.0μg/kg，99.4%；⑥氯胺酮：y=1.29×106＋2.16×106x，0.991,4.0μg/kg，99.1%；⑦杜冷丁：y=4.21×106＋1.25×107x，0.993，1.0μg/kg，98.5%；⑧丁卡因：y=2.19×105＋3.98×105x，0.995，5.0μg/kg，95.6%；⑨安定：y= 3.59×106＋1.46×106x，0.994，2.0μg/kg，94.8%；⑩吗啡：y=0.21×103＋2.97×104x，0.985，2.0μg/kg，95.6%；⑪去甲羟基安定：y=3.83×106＋1.98×106x，0.991，2.0μg/kg，99.1%；⑫舒乐安定：y=2.24×106＋3.04× 106x，0.990，4.0μg/kg，97.4%；⑬可待因：y=6.57×105＋5.90×105x，0.986，5.0μg/kg，97.3%；⑭利眠宁:y=1.12×105＋2.53×105x，0.987，2.0μg/kg，98.6%；⑮咪达唑仑:y=0.93×106＋3.06×106x，0.983，3.0μg/ kg，97.4%；⑯美沙酮:y=2.03×106＋3.54×106x，0.991，4.0μg/kg，97.9%；⑰蒂巴因:y=1.38×105＋2.96×105x，0.992，3.0μg/kg，98.5%；⑱四氢大麻酚:y=-2.17×104＋2.75×104x，0.972，2.0μg/kg，98.4%；⑲三唑仑:y=3.19×105＋2.45×106x，0.984，2.0μg/kg，96.8%；⑳氯氮平: y=1.07×106＋3.05×106x，0.991，2.0μg/kg，100.56%。20种毒品的线性方程相关性r在0.970以上，在1.0～100μg/kg之间呈现良好的线性关系，回收率在94～102%之间，检出限1.0～5.0μg/kg，均符合要求。

20种毒品标准品多反应检测总离子流图见图1，可见标准对照品离子峰显现较好，无杂峰。

2.2 待测样本以及健康人群检出情况

健康人群检出咖啡因阳性1例，正常人空白血液样品色谱图如下图2。对吸毒人员的血样进行检验，10份样本全部检出了毒品成分，吗啡6例、苯佐卡因阳性3例、可待因2例、甲基苯丙胺1例、四氢大麻酚4例、去甲羟基安定5例，绝大多数检出了多种毒品成分。图3为检出基苯丙胺的对象血液样本色谱图。

图2 正常人空白血液样品色谱图

图3 1例检出甲基苯丙胺血液样品色谱图

3 讨论

根据我国《刑法》第357条规定，毒品主要是指鸦片、海洛因、甲基苯丙胺（冰毒）、吗啡、大麻等管制的能够使人形成瘾癖的麻醉药物和精神药物。通常而言，毒品可分为麻醉药物与精神类两类。在我国使用量较大的毒品主要是海洛因、甲基苯丙胺、吗啡、大麻等。人在吸毒后，血液、尿液等代谢物中会存在毒品的原体以及代谢物，对这些物质进行含量检测，能够判断人过去一段时间内是否有应用毒品的历史。血液检验不同于尿液检验，获得的样本质量控制相对容易，同时原药含量相对较高，检验机构采集样本也更为容易，不容易受到肾脏功能等代谢因素的影响，在国际上血样检验兴奋剂的检出率也远高于尿液检验。血液毒品检验的方法较多，包括免疫学检验、薄层色谱、高效液相色谱，不同技术各有优劣，仪器联用越来越受到重视。高液相色谱-质谱/质谱法检测是应用最广泛的联用技术之一，可以应对层出不穷的新型毒品，依次分离、定性、定量分析，适合确证分析，而确证分析是吸毒史鉴定的最终目的。

高液相色谱-质谱/质谱法检测可同时检测血液样本中的多种毒品成分残留，本次研究建立了20种常见毒品残留量色谱质谱联合检测体系。具有以下优势：①可同时检测，可进行成分检测，具体分析毒品的种类，从而有针对性的分析当前吸毒情况，当然需注意的毒品本身在人体内可能会出现成分变化，需要做好药理学分析[3]；②回收率、精密度较高优势，相关系数均大于0.970，线性范围1.0～100μg/kg，RSD均小于3%，检出限1.0～5.0μg/kg,精密度实验、稳定性、重现性试验相对保留时间RSD（%）、相对峰面积RSD（%）均小于3%，符合试验的要求，回收RSD在94～102%之间，回收率也较好，可有效的降低偏差，需注意的是，因毒品的种类较多，建立线性方程、有效性验证过程中基础工作量大。未进行检测条件的优化，也需要进行关联试验，做好数据管理，从其他渠道获得已有的数据资料，以缩短研究的过程中，提高测试整体效率。③有必要了解检查地区的毒品检测结果流行情况，对于分析毒品的来源，打击毒品犯罪具有重要意义。

高效液相色谱-串联质谱联用技术检测毒品方法不仅可用于人体样本的检测，还可用于药物检测。许多药物如抗风湿类药物、解热镇咳类药物，可能会添加非法添加剂，其中不乏毒品，如咖啡因。另外许多毒品被用作医疗领域，如咪达唑仑是一种临床常用的镇定剂，也可用于医疗事故责任鉴定。

当然，本次研究目标毒品的数量仅为20类，实际上毒品的种类远不止这些，且仍在不断增多。当前，新的毒品层出不穷，制作贩卖毒品的犯罪分子也在尝试制作反检测的毒品，采用常规的血液检测技术检出较困难。高效液相色谱-串联质谱法测定相较于普通的色谱检测等技术，灵敏性较好，即使是缺乏标准品，也能够较容易的检出异常的离子峰，对于新毒品的发现也有重要意义。需注意的是，无吸毒史人群也可能因用药导致出现异常色谱峰、离子峰，需要慎重对待，做好数据的对比工作，避免误检[4]。为快速的检出毒品的类型，实验室还需加强信息建设，建立不同毒品的血液样本浓度与检测目标值之间的数据库，必要时采用智能化的离子峰图形匹配分析技术，快速进行检测峰与数据库中的毒品峰对照，快速分析毒品类型。再先进的技术，其检验的效果也会受到检验的质控水平影响，对于高液相色谱-质谱/质谱法检测而言，选择合适的样本预处理非常重要，同时不同的毒品其性质不尽相同，不同的物质适合的检验条件不尽相同，这就要求需要对检验条件的优化，以提高检验的质量，今后有必要开展这方面的研究。

综上所述，高效液相色谱-串联质谱法可同时测定人血液中多种毒品残留，结果准确可靠。

[1]联合国毒品犯罪局.2012世界毒品报告[R].2012.

[2]邸玉敏,朱军,常靖,等.GC/MS、GC/NPD法检测血液中氯胺酮[J].中国法医学杂质,2010,25（3）:169-171.

[3]张睿,王海涛,吴斌,等.高效液相色谱-串联质谱法检测人血液中常见毒品残留量[J].分析试验室,2011,30（10）:71-74.

[4]M.Cruz-Vera,R.Lucena,S.Ca′rdenas,et al.Sorptive microextrac⁃tion for liquid-chromat ographic determination of drugs in urine[J]. Trends in Analytical Chemistry,2009,28（10）:1164-1173.