野生蒲公英花多酚的提取和体外抗氧化活性研究

臧延青，何飞，李执坤，冯艳钰，张超

（黑龙江八一农垦大学，大庆 163319）

野生蒲公英花多酚的提取和体外抗氧化活性研究

臧延青，何飞，李执坤，冯艳钰，张超

（黑龙江八一农垦大学，大庆 163319）

以Fenlin-Ciocalten法测定蒲公英花多酚（DFP）含量，通过单因素和正交实验来确定DFP的最佳提取条件，并对其体外抗氧化活性进行了研究。实验结果表明，最佳提取工艺为：乙醇体积分数40%，料液比1∶15（g·mL-1），提取温度40℃，提取时间

40 min。在最优提取条件下DFP的得率为2.31%。抗氧化试验结果显示，在一定浓度范围内DFP对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、羟自由基（·OH）、超氧阴离子自由基（O2-·）的清除率分别为68.43%、89.35%、76.55%，表现出良好的抗氧化能力。表明东北野生蒲公英可以作为功能性食品原料具有良好的开发前景。

蒲公英花；多酚；提取工艺；抗氧化活性

蒲公英（Toraxacum mongolicum Hand.Mazz）是菊科植物中的一种多年生草本植物，原产于欧洲，广泛分布于北半球的暖温带地区[1]。我国大部分地区均有分布，资源丰富，据《本草纲目》记载，蒲公英性平味甘、微苦、性寒、有清热解热消肿之用，且对治疗肝热目肿痛、热毒所致的疮毒有良好的功效[2]。《神农本草经》《唐本草》等也对蒲公英在利尿、缓泻、退黄疸、利胆的功效方面进行了更全面的描述，并对其给予了高度评价[3]。现代研究表明，蒲公英具有抑菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等功效，在食品、药品、保健品等方面具有良好的开发前景及应用价值[4]。蒲公英含有多种化合物，国内外学者已从蒲公英中提取分离出许多化学成分，主要包括黄酮类、倍半萜内酯类、香豆素类、三萜类、植物甾醇类、酚酸类、胡萝卜素类等，此外还含有多种脂肪酸、糖、胆碱、维生素、矿物质、果胶、蛋白质物质[5]。

植物多酚在抗氧化、抗诱变、抗肿瘤、抗病毒、降血脂、抗衰老等很多方面具有良好的生物活性和药理活性[6-9]。蒲公英的生物活性成分被不断发现和证实，研究表明，蒲公英叶片提取物具有治疗非酒精脂肪肝的效果[10]，蒲公英根提取物可以杀伤前列腺癌细胞[11]，蒲公英水提物能够抵抗流感病毒[12]。目前，蒲公英的功效研究多集中在叶片及根的健康功效，对于蒲公英花中所含多酚的研究较少。我们通过实验初步研究了东北野生蒲公英花多酚的提取工艺及其抗氧化活性，为开发经济的天然抗氧化剂和功能性食品提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

东北野生蒲公英花，2013年5～6月采于黑龙江省大庆市萨尔图区，55℃烘干冷藏，粉碎，60目过筛，备用。

1.2 仪器与试剂

722 s分光光度计，上海分析仪器总厂制造；DGG-9140B型电热恒温鼓风干燥箱上海森信公司；HH-1数显恒温水浴锅江苏省荣华仪器制造有限公司；HH.W21.600型电热恒温水箱江苏省荣华仪器制造有限公司；SHB-ⅢA循环水式多用真空泵郑州长城科工贸有限公司。

茶多酚北京中生泰瑞科技有限公司，纯度≥98%；DPPH日本Ruitaibio公司；没食子酸上海谷研实业有限公司，纯度≥98%；其他试剂均为分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1 没食子酸标准曲线的制作及蒲公英花多酚量测定

配制0.5 mg·mL-1没食子酸标准溶液50 mL，分别取溶液0、1、2、3、4、5、6 mL，置于25 mL容量瓶中，蒸馏水定容。分别取5 mL于100 mL容量瓶中，加入4 mL Folin试剂，摇匀，静置4～5 min。然后加入8 mL 10%Na2CO3溶液，75℃恒温水浴10 min。显色之后在765 nm波长处测定吸光度值，绘制标准曲线[13]。

称取蒲公英花粉末1.00 g，在一定条件下浸提、抽滤，重复两次，合并上清液，浓缩，除去乙醇，测定多酚含量。

多酚含量计算公式：

蒲公英花多酚（%）=（m/M）×100%

m-提取物质量，M-蒲公英花质量

1.3.2 蒲公英花多酚提取工艺条件

称取1 g蒲公英花粉末，选取料液比、乙醇体积分数、提取时间和提取温度四个因素进行单因素实验。以多酚提取量为考察指标，乙醇体积分数（30%、40%、50%、60%、70%），提取温度（30、40、50、60、70℃），料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30），提取时间（30、40、50、60、70 min）作为试验因素，研究各个因素对DFP提取量的影响。在单因素基础上，采用4因素3水平正交设计探讨DFP提取的最佳工艺。因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1Factors and levels of orthogonal array design

1.3.3 蒲公英花多酚对DPPH自由基清除率的测定

采用周向军等[14]的方法并稍作修改，以95%乙醇为溶剂准确配制成0.1 mg·L-1DPPH溶液。取DPPH溶液3 mL，加入1 mL DFP样液，摇匀，避光静置30 min，于517 nm处测定吸光度值。按照相同方法分别测定1 mL 95%乙醇溶剂与3 mL DPPH溶液，1 mL DFP样液与3 mL 95%乙醇溶液在517 nm处的吸光度值。用茶多酚（TP）代替DFP进行阳性对照，每个DFP样液进行3次平行试验。

DPPH清除率按如下公式计算：

式中：A1—DFP样液与DPPH测定的吸光度值；

A2—95%乙醇与DPPH测定的吸光度值；

A3—DFP样液与95%乙醇测定的吸光度值。

1.3.4 蒲公英花多酚对羟基自由基（·OH）清除率的测定

采用王永宁等[15]的方法并稍作修改，在25 mL试管中依次加入5 mL 2 mmol·L-1硫酸亚铁溶液和5 mL的6 mmol·L-1双氧水溶液，混合均匀后用6 mmol·L-1水杨酸滴定至刻度。在36～37℃条件下恒温水浴15 min，在510 nm处测定吸光度为A0。重新配制一份上述体系的溶液，在相同条件下，加入1 mL DFP样液。混匀后，于36～37℃条件下恒温水浴15 min，测定在510 nm处的吸光度值为Ax。用茶多酚（TP）代替DFP进行阳性对照，每个样品进行3次平行试验。

羟基自由基清除率计算公式如下：

向10 mL试管中先后加入5 mL pH=8.4的磷酸盐缓冲液，2 mLDFP样液，0.1 mL 4.5 mmol·L-1邻苯三酚溶液。25℃条件下恒温水浴10 min，加入2滴盐酸终止反应，于420 nm处测定吸光度值，记为Ai。同时，向空白管依次加入5 mL PH=8.4的磷酸盐缓冲液，2 mL蒸馏水，0.1 mL 4.5 mmol·L-1邻苯三酚溶液。于420 nm处测定吸光度值，记为Aj。用茶多酚（TP）代替DFP进行阳性对照，每个样品进行3次平行试验[16]。

超氧阴离子清除率计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 没食子酸标准曲线

以没食子酸为标准品，按1.3.1所述操作，得没食子酸标准曲线，标准曲线方程为y=0.011 0 x+0.002 5，R2=0.992 2。说明没食子酸在浓度0～60 μg·mL-1范围内线性良好。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 乙醇体积分数对蒲公英花多酚提取率的影响

图1 乙醇体积分数对DFP提取量的影响Fig.1The effect of ethanol concentration on extraction rate of DFP

由图1可知，随着乙醇体积分数的升高，DFP的提取率先增加后缓慢减小。低浓度乙醇提取时，随着乙醇体积分数的增加，溶液之间的氢键和疏水键相互作用，使得DFP能更好的被提取出来。当乙醇体积分数达到50%时，也达到最大的提取率。继续增大乙醇体积分数时，有机溶剂与蒲公英花多酚极性差异变大，多酚提取率不再增加，甚至会缓慢下降[17]。因此，采用50%的乙醇体积分数，能使DFP提取率达到最大，为最佳提取条件。

2.2.2 提取温度对蒲公英花多酚提取率的影响

图2 提取温度对DFP提取率的影响Fig.2TheeffectofextractiontemperatureonextractionrateofDFP

由图2可知，提取温度对DFP的提取率具有较大的影响。在30～50℃范围内，随着提取温度的升高，DFP的提取率呈上升趋势，且增加幅度较大。原因可能是升温加快了分子运动，也更快的使细胞壁破裂，更好的使多酚物质溶解出来。50℃以后，DFP的提取率明显下降。可能是由于高温使多酚类物质发生氧化或降解反应[18]。当温度过高时，乙醇容易挥发，浸提溶剂减少，DFP得不到充分溶解，从而致使多酚得率下降。综合酚类的稳定性和乙醇的挥发性，以50℃的提取温度作为最佳提取条件。

2.2.3 料液比对蒲公英花多酚提取率的影响

图3 料液比对DFP提取率的影响Fig.3Theeffectofmaterial-to-liquidratioonextractionrateofDFP

由图3可知，在料液比为1∶10到1∶25的范围内，随着料液比的增大，DFP的提取率也在增加。当料液比为1∶25时，达到最大提取率。然而当料液比继续增大时，DFP的提取率略有下降，总体料液比对多酚提取的影响不大。综合从降低能耗，节约材料方面考虑，料液比选用1∶25为最佳提取条件。

2.2.4 提取时间对蒲公英花多酚提取率的影响

图4 提取时间对DFP提取量的影响Fig.4The effect of extraction time on extraction rate of DFP

由图4可知，前期随着提取时间的增加，DFP提取率逐渐增加。但在40 min后，随着时间的增加，多酚得率反而逐渐下降。这可能是开始时DFP含量高，提取速率较大，随着时间增加，而多酚提取率也就越高。随着时间的延长，多酚长时间在浸提液中受热，不停的进行降解、缩合、氧化等反应，结构被破坏，从而降低了DFP的提取率[18]。因此，提取时间40 min为最佳提取条件。

2.3 蒲公英花多酚提取的正交试验结果分析

由表2的结果分析可知，DFP提取率的影响因素主次顺序为：C＞A＞B＞D，即料液比＞乙醇体积分数＞提取温度＞提取时间。由k值可以分析得知，DFP的最佳提取条件为A1B1C2D1，即乙醇体积分数为40%，提取温度为40℃，料液比为1∶15，提取时间为40 min。

表2 正交试验设计及结果Table 2Orthogonal array design and results

2.4 DFP对DPPH自由基的清除作用

由实验可知，在相同浓度梯度下，DFP对DPPH自由基的最大清除率为68.43%，阳性对照的TP对DPPH自由基的最大清除率为64.18%。由图6可知，随着样液浓度增大，对DPPH自由基的清除能力也随之增强。且DFP和TP对DPPH自由基的清除率都较高，浓度在0.15 mg·mL-1前，TP的清除效果优于DFP；在0.15 mg·mL-1后，DFP的清除效率明显开始高于茶多酚的清除效率。因此在一定浓度范围内，相同浓度的DFP对DPPH自由基的清除能力优于TP。

2.5 DFP对羟基自由基的清除作用

由实验可知，在0.1～0.3 mg·mL-1的样品浓度中，DFP对羟基自由基的最大清除率为89.30%；TP对羟基自由基的最大清除率为74.54%。

由图6可知，随着DFP浓度的增加，对羟基自由基的清除作用成线性增强。而DFP的清除率明显大于茶多酚，在样品浓度为0.3 mg·mL-1时达到最大清除率。因此，在一定的浓度范围内，DFP对羟基自由基的清除能力优于同浓度的TP。

图5 DFP对DPPH自由基的清除作用Fig.5The scavenging ability of DFP against DPPH free radicals

图6 DFP对羟基自由基的清除作用Fig.6The scavenging ability of DFP against·OH

2.6 DFP对超氧阴离子自由基的清除作用

图7 DFP对超氧阴离子自由基的清除作用Fig.7The scavenging ability of DFP against superoxide radicals

超氧阴离子自由基的衍生物过氧化物和羟自由基具有细胞毒性，且超氧阴离子自由基本身也具有毒害作用[19]。邻苯三酚在碱性条件下迅速自氧化，由于自氧化速率依赖的浓度，清除抑制自氧化反应，由此来评价样品清除的能力[20]。

由实验可知，在0.1 mg·mL-1到0.3 mg·mL-1的样品浓度中，DFP对超氧阴离子自由基的最大清除率为76.55%；TP对超氧阴离子自由基的最大清除率为71.14%。

由图7可知，随着DFP浓度的增加，DFP和TP对超氧阴离子自由基的清除率增强。在样品浓度0.2 mg·mL-1以下，清除率增大幅度较大，0.2 mg·mL-1以后，变化相对较小。因此，在一定的浓度范围内，DFP对超氧阴离子自由基的清除能力较强。

3 结论

实验通过单因素和正交试验研究了东北野生蒲公英花多酚提取的最佳条件。并在此基础上对其体外抗氧化活性进行了研究。

众多学者研究表明，蒲公英叶片及根多酚提取物具有一定的活性[10-12]。但是对于蒲公英花多酚的活性研究较少，尤其东北野生蒲公英花多酚对于DPPH清除能力的研究未见报道。抗氧化试验表明，东北野生蒲公英花多酚对DPPH、羟基自由基、超氧阴离子自由基都具有一定的清除作用，且清除率与蒲公英花多酚浓度成量效关系。与茶多酚清除自由基能力比较，东北野生蒲公英花多酚对DPPH、羟基自由基、超氧阴离子自由基的清除能力都优于茶多酚，表现出良好的抗氧化活性，作为天然食品添加剂具有良好的开发前景。

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Extraction and Antioxidant Activity in vitro of Polyphenols from Northeast Wild Dandelion Flowers（Toraxacum mongolicum Hand.Mazz）

Zang Yanqing，He Fei，Li Zhikun，Feng Yanyu，Zhang Chao
（Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

The optimization extraction of total polyphenols from northeast wild dandelion flowers was studied by single factor test and orthogonal test.Results showed that the optimal conditions were 40%ethanol solvent，extraction temperature 40℃，1∶15 ratio of material to ethanol，extraction time 40 min.Under the extraction conditions，the extraction rate of total polyphenols was 2.31%. Antioxidant activities in vitro of the dandelion flower polyphenols（DFP）were investigated in three different assays，including scavenging activities of hydroxyl free radicals（·OH），superoxide anion（O2-·）and 1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-Diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl（DPPH）free radicals.Results showed that the highest scavenging rates for the radicals were 89.35%，76.55%and 68.43%，respectively.As a conclusion，DFP had good eliminate ability of free radical，could be used as functional food material.

dandelion flowers；polyphenols；extraction；antioxidant activity

TS207.3

A

1002-2090（2017）04-0062-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.04.014

2016-12-12

2015年省级大学生创新训练项目（201510223022）。

臧延青（1974-），女，讲师，日本岩手大学毕业，现主要从事功能性食品方面的研究工作。