慈竹CBF1全长基因的克隆及其分析

蒋 瑶，陈文波，陈其兵

(1.凯里学院环境与生命科学学院，贵州 凯里 556011； 2.四川农业大学风景园林学院，四川 成都 611130)

慈竹CBF1全长基因的克隆及其分析

蒋 瑶1，2，陈文波1，陈其兵2

(1.凯里学院环境与生命科学学院，贵州 凯里 556011； 2.四川农业大学风景园林学院，四川 成都 611130)

分离和克隆慈竹CBF1基因，探明低温下转基因烟草诱导的表达情况，以慈竹叶片为材料，通过RT-PCR和RACE技术克隆慈竹CBF1基因的全长cDNA序列，并进行生物信息学分析；同时选用转基因烟草T2代株系为材料，进行半定量RT-PCR，分析NaCBF1基因在烟草中的表达情况。结果表明：克隆得到慈竹NaCBF1基因(GenBank登陆号为JN896707)，全长序列为1 051 bp，其中包括5′-UTR 54 bp，3′-UTR 334 bp，编码区663 bp，编码223个氨基酸，分子量为23.48 kDa，等电点为5.27，为不稳定疏水性蛋白。氨基酸序列比对分析表明，NaCBF1与CtCBF1、HvCBF1和TaCBF1一致性分别为93%、86%和85%，且NaCBF1与CtCBF1、PeDREB1聚为一类。不同低温胁迫下，转NaCBF1基因烟草植株均能正常转录，表明具有耐寒性。NaCBF1参与植物对低温胁迫的调控，对其环境胁迫响应还有待探讨，为进一步分析其在不同信号途径相互作用中的功能和调控机制提供有力证据。

慈竹；CBF1；基因克隆；基因表达

低温是影响植物生长、发育的主要因子之一，经低温胁迫后会受到不同程度的伤害，主要包括低温感受、低温转导和转录调控等多个阶段[1]，CBF是一类与植物逆境胁迫(如低温、干旱及高盐等)相关的转录因子，且逐渐成为植物抗寒研究的热点之一[2]，其中CBF1转录因子是植物抗冷驯化过程中起关键作用的一个因子[3]，其结构具有AP2结构域，其基因与顺式作用元件CRT/DRE结合，其上游含有ICE1基因，在逆境胁迫中起着重要调控作用[4]，并能诱导胁迫下游COR基因的表达，提高植物的非生物逆境胁迫能力[5]。近年来研究表明，已从番茄[6]、山葡萄[7]、草莓[8]、油棕[9]、茶树[10]、二穗短柄草[11]、猕猴桃[12]等多种植物中分离出CBF类似基因，从而引起植物体内的多种生理生化过程变化，能够有效提高植物抗寒能力，这一机制可有效减少植株能量损失，从而保证植物生长发育正常。

CBF1转录因子不仅参与低温下诱导的表达，还参与其他胁迫诱导的表达。低温、干旱、高盐和ABA条件下能诱导苹果MdDREB1表达[13]。ABA和干旱胁迫下能瞬时诱导PdCBF1表达[14]。实时荧光定量PCR分析结果表明，不同处理(低温、干旱、盐及ABA等)均能诱导扁桃SG-AcCBF1基因的表达[15]。与野生植株相比，低温处理拟南芥植株，发现AtCBF1基因的转录水平均高于常温生长的植株，在1 h内表达量有所提高，3 h达到最高峰，一直保持到12 h[16]。

慈竹(Neosinocalamusaffinis)是禾本科(Gramineae)竹亚科(Bambusoideae)植物，也是四川省广泛分布和栽培的经济竹种之一，经低温胁迫后，发生倒伏、竹兜腐坏，影响竹浆造纸，为提高慈竹抗逆性、筛选抗性相关基因、了解抗逆机理势在必行，但通过分子育种提高慈竹耐寒性研究甚少，因此，以慈竹叶片为试材，通过克隆慈竹NaCBF1全长基因，对其序列进行生物信息学分析，并检测其基因在低温下的诱导表达，以期为进一步开展CBF1基因功能和蛋白质的特性研究提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

3年生健壮、无病害的慈竹枝条采自四川农业大学成都竹园带回实验室，取其叶片(去叶脉)置于液氮罐中2 min，再放置于-80 ℃超低温冰柜中。

1.2 方法

1.2.1 慈竹叶片组织中总RNA的提取 利用RNAprep pure 植物总RNA提取试剂盒提取慈竹叶片组织中总RNA，并用琼脂糖凝胶电泳检测完整性和紫外分光光度计检测纯度。

1.2.2NaCBF1基因序列的克隆 参照protoScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(NEB)提供的反应条件合成cDNA，反应产物保存于-20 ℃。

根据Genbank不同植物CBF1蛋白保守域设计简并引物(NaCBF1-1F：5′-CCG AAG AAR CCN GCG GGN CGG AAG AAG T-3′，NaCBF1-1R：5′-AAG CGG AGT CGG CGA AGT TGA GGC ANG c -3′)，采用Touch-down PCR进行扩增，反应条件为：95 ℃变性30 s，70 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，以后每个循环的退火温度降低1 ℃，共5个循环；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，以后每个循环的退火温度降低1 ℃，共5个循环；95 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，25个循环，72 ℃延伸10 min。

根据保守区测序结果在5′端和3′端分别设计两条引物(5′-Outer primer：5′-CCC GCC GTA TCT CGT CGT GT-3′，5′-Inner primer：5′-CGG CGA GTC GGC GAA GTT GA-3′； 3′ -Outer primer：5′- GGA CGT TGC TGC GAT CAG -3′，3′-Inner primer：5′- GGG GCG GAC CAA GTT CAA -3′)。PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30个循环，72 ℃延伸10 min。①95 ℃变性30 s；②61 ℃退火30 s；③72 ℃延伸90 s；循环①～③，35个循环；④72 ℃延伸10 min。

将5′端和3′端测序结果与保守区片段拼接得到全长序列，根据拼接序列设计编码区全长cDNA序列的特异引物(NaCBF1-2F：5′- ATG GAC GTT GCT GCG ATC AGC AGC-3′，NaCBF1-2R：5′- TCA GTA GCT CCA TAG CCT GAC CTC-3′)，以慈竹叶片组织中cDNA为模板，PCR反应条件为：95 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环，72 ℃延伸10 min。

PCR产物目采用胶回收试剂盒回收，回收产物用pGM-T vector 16 ℃连接转化大肠埃希菌E.coilTop10，筛选出阳性克隆送华大基因测序，测序结果利用DNAMAN、Mega5.0和ClustalX进行序列分析。

1.2.3NaCBF1基因的生物信息学分析 利用ExPaSy ProtScale软件和SOPMA软件分别进行亲/疏水性和α-螺旋(α-helix，H)、β-转角(β-turn，T)、无规卷曲(random coil，C)以及延伸连(extended strand，E)进行分析，同时利用Mega5.0构建系统树，采用Swiss-Model程序进行同源模建[17]。

1.2.4 转基因烟草T2代半定量PCR 对T2代植株(转基因型和野生型)进行不同温度(15、4、0和-2 ℃)处理，分别提取转基因阳性株系和野生型株系叶片总RNA，反转录为cDNA后进行RT-PCR，烟草β-actin作为内参。

2 结果与分析

2.1NaCBF1基因编码区全长cDNA的克隆和序列分析

以慈竹叶片总RNA反转录得到的cDNA，采用简并引物(NaCBF1-1F和NaCBF1-1R)进行RT-PCR扩增，经切胶回收、连接转化和测序，证实保守区片段长度为480 bp图1a，与预测目的片段大小基本一致。

根据保守区片段，采用RACE技术，分别设计5′端和3′端引物，PCR扩增得到5′端373 bp，3′端897 bp的片段，将3段核苷酸序列进行拼接，得到一个长为1 051 bp的预测片段。再将其拼接的序列设计一对特异引物NaCBF1-2F和NaCBF1-2R，通过RT-PCR扩增得到编码区650 bp的cDNA片段(图1b)。经测序后进行BLAST同源性分析，确认得到1条cDNA序列，命名为NaCBF1，GenBank登录号为JN896707。

图1 慈竹NaCBF1基因保守片段PCR产物(a)和编码区全长PCR产物(b)Fig.1 PCR products of conservative domain and coding region fragment of NaCBF1 gene注：M. DL2000分子标记；1、2：PCR产物(a)，1-3：PCR产物(b)。Note:M. DL2000 marker; 1,2 PCR products; 1-3 PCR products

利用DNAMAN软件分析NaCBF1基因，该cDNA片段长1 051 bp，其中包含5′端非编码区54 bp，663 bp ORF，3′端非编码区334 bp，末端还有poly(A)16结构。通过生物信息学软件分析可得，ORF编码221个氨基酸，分子量为23.48 kDa，等电点为5.27，其中主要氨基酸Ala含量为11.9%，Pro含量为8.5%，推测其为不稳定疏水性蛋白。

进一步分析表明，NaCBF1编码的氨基酸序列中存在一个保守的AP2结构域和两段段特征序列DSPRR和LWSY(图2)的特异氨基酸，且在AP2保守区与其他植物高度同源。此外，作为AP2结构域功能性保守氨基酸第14位的缬氨酸(14V)和第19位的谷氨酸(19E)仍存在NaCBF1中保守，这些都符合CBF/DREB转录因子的特征。

图2 NaCBF1cDNA的核苷酸序列(上排)和推导氨基酸序列(下排)Fig.2 Schematic representation of the nucleotide sequences(upper lines) and its deduced amino acid sequences(lower lines) of NaCBF1 cDNA注：小写部分为非编码区，ATG为起始密码子，TGA为终止密码子，下划线为核定位序列(NLS)，双下划线为AP2结构域，方框为特征基序。Note:The lower-case characters indicate noncoding regions,indicates the start codon,indicates the stop codon,underline indicate the basic nuclear localization signals (NLS),double underline indicate AP2 domain,box indicate the characteristic sequence

用ProtScale的Kyte 和Doolittle算法对NaCBF1基因编码氨基酸序列的疏水性/亲水性进行预测。结果表明，NaCBF1基因编码氨基酸序列偏向于亲水性，大约在23-24区域具有很强的亲水性，59-60区域具有较强的疏水性。用SOPMA预测NaCBF1基因编码氨基酸序列的二级结构，发现包含38.75%的α-螺旋、14.37%的延伸链、5.62%的β-转角和41.25%的无规则卷曲结构，且α-螺旋和无规则卷曲成为最大量的结构元件，而β-转角和延伸链则散布于整个蛋白质中，说明是AP2结构域的特征。

通过Blast比对分析，可知NaCBF1与CtCBF1(筇竹)[18]、HvCBF1(大麦)[19]和TaCBF1(小麦)[20]同源性较高，且一致性分别为93%、86%和85%，由此表明NaCBF1与CtCBF1的亲缘关系最近。经Swiss-model同源建模NaCBF1蛋白，发现含有α-螺旋、β-转角和β-折叠片3种结构，其中α-螺旋可能与其它转录因子或DNA相互作用有关，而β-折叠可识别顺式作用元件，由此可看到其蛋白折叠空间结构构象的变化。

通过Mega6.0软件构建系统发育树发现(图3)，NaCBF1与CtCBF1、PeDREB1(毛竹)[21]聚为一类，说明其亲缘关系相近，但利用氨基酸序列比对说明(图4)，PeDREB1与NaCBF1、CtCBF1核定位信号区域PKRRAGRTKFKETRHP存在较大差异，以及羧基末端保守基序LWSY存在由W变成L 的1个氨基酸变异，可能导致转录激活的差异，NaCBF1与CtCBF1保守区域存在少部分氨基酸的差异，由此推测不同竹种间的基因结构域的差异，从而导致不同竹种间的抗寒性也存在不同。

图3 系统发育树Fig.3 The phylogenetic tree

图4 NaCBF1与其他部分植物的CBF1氨基酸序列比对Fig.4 Multiple amino acid sequence alignment of CBF1 from Neosinocalamus affinis and other plant species

图5 不同温度胁迫下CBF1过表达转基因烟草的半定量RT-PCR鉴定Fig.5 Semiquantitative RT-PCR analysis of overexpression NaCBF1 gene in transgenic tobacco leaves under different temperature stresses

2.2 不同温度胁迫下T2代转基因烟草的半定量RT-PCR分析

分别提取不同温度处理下PCR鉴定为阳性的转基因烟草株系(OE1 、OE2和OE3)和野生型烟草WT株系叶片的RNA，反转录为cDNA后进行RT-PCR，内参为烟草β-actin。在不同温度处理下，过表达转基因烟草OE1、OE2和OE3株系中均扩增出NaCBF1基因特异性条带和β-actin内参基因条带，而野生型烟草WT中只有β-actin内参基因条带(图5)。由此表明，NaCBF1基因在转基因烟草植株中能够正常转录，且具有一定的耐寒性。

3 讨论

对于竹亚科植物而言，温度信号是调控植物冷驯化的因子，也是保证植物顺利过冬的因素。CBF1基因功能以及在抗寒机理所起的作用在许多文献中已有相关报道[22]，CBF1蛋白的AP2结合域第14位的缬氨酸(14V)和第19位的谷氨酸(19E)可能决定着CBF/DREB蛋白的DNA结合特性，本研究NaCBF1蛋白中也存在14V和19E氨基酸的保守性，可能决定NaCBF1蛋白对顺式作用元件ACCGAC和GCCGAT(CRT元件的核心序列)具有相同的结合活性。CBF1转录因子一般含有PKK/RAGRxKFxETRH序列[23]，位于AP2 DNA结合域的上游，可能与蛋白质运输有关[24]，而DSAWR序列多位于AP2 DNA结合域的下游，这两段短多肽序列均是特征基序，在进化程度不同的物种中保守存在。本研究表明，NaCBF1蛋白与CBF1蛋白AP2 DNA结合域上游序列一致，而下游序列为DSPRR，存在有2个氨基酸(P和R)的变异，可能正是由于 CBF蛋白这种既有较高的保守区，又有较高可变区的特点，保证了CBF转录因子与DNA结合的专一性及在激活功能上的多样性，为后续的功能验证以及分子标记辅助育种奠定基础。

序列比对表明，NaCBF1与筇竹、大麦和小麦等单子叶植物具有较高的同源性，都具有AP2保守功能域，同源性在 85%及以上，该区域与DNA 结合至关重要[25]，进一步说明NaCBF1可能是CBF1在慈竹中的同源基因。通过对NaCBF1蛋白三级结构分析表明，含有1个α-螺旋和3个β-折叠，符合CBF转录因子的特征结构[26-27]。

研究表明，经过低温胁迫后CBF的表达量会迅速增高[17]。受低温胁迫的梁山慈竹再生植株随温度的降低其表达量升高[28]。低温胁迫后的桑树苗幼叶，能检测到桑树CBF1基因表达，随后其转录水平迅速增加，在胁迫3 d后其表达量最高[14]。这些结果都说明，可能由于不同的逆境胁迫或逆境调控机制导致了CBF基因表达的差异。将NaCBF1转入模式植物中，结果表明，其基因表达量高于对照，与张俊环[30]、周伟[31]等研究结果一致。该基因受低温胁迫的诱导，为其是低温胁迫转录因子提供了证据，推测在慈竹可能存在CBF1抗寒机制，可能参与了慈竹在逆境中的调控，但对于NaCBF1基因的功能及调控作用还有待于进一步的研究。以期通过模式植物的功能分析来进一步了解其是如何通过转录水平来调控下游功能基因的响应。已有研究表明，CBF/DREB可响应多种非生物胁迫，不同植物由于氨基酸组成的差异是否改变蛋白质的高级结构，进而影响植物对不同环境胁迫的响应机制。同时，基因的转录还取决于基因的启动子序列，需进一步分离NaCBF1启动子序列，对启动子序列进行结构和功能的深入研究，以期获得关于NaCBF1基因表达调控的更多信息。

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Molecular Cloning and Expression Analysis ofCBF1 Gene inNeosinocalamusaffinis

JIANG Yao1,2，CHEN Wen-bo1，CHEN Qi-bing2

(1.College of Environment and Life Science,Kaili University,Kaili 556011,Guizhou,China;2.College of Landscape Architecture,Sichuan Agriculture University,Chengdu 611130,Sichuan,China)

The aim of this study was to isolate ofCBF1 gene fromNeosinocalamusaffinisand analyze its expression patterns in the transgenic tobacco under low temperature stresses. In this experiment，the leaves ofNeosinocalamusaffiniswas used as material,the full length cDNA sequence ofNeosinocalamusaffinisCBF1 transcription factor gene was cloned by using RT-PCR and RACE techniques．The expression ofNaCBF1 gene in the T2lines of trangentic tobacco was analyzed by using semi-quantitative RT-PCR. The results showed that the gene was designated asNaCBF1 that GenBank accession number was JN896707. This gene was 1051 bp DNA fragment in full length，including a 5′-UTR (untranslated region) of 54 bp,a 3′-UTR of 334 bp and opening reading-frame (ORF) was 663 bp，encoding 221 amino acids with a conservative DNA binding domain. Its relative molecular mass was approximately 23.48kDa and isoelectric point was 5.27. After alignment of amino acid,the sequence ofNaCBF1 gene was respectively 93%,86% and 85% identical toCBF1 gene ofChimonobambusatumidissinoda,HordeumvulgareandTriticumaestivum.NaCBF1,CtCBF1andPeDREB1 were clustered into one group. The transcript level was increased in response to cold stress. It confirmed thatNaCBF1was related to the stress response, andNaCBF1 was related to the environmental stress. It was the basis for the research of gene structure and biological function,and for the analysis of the function of interaction in different signal pathway and regulating mechanism.

Neosinocalamusaffinis; CRT-binding factor1; Gene clone; Gene expression

2016-09-28

贵州省科技厅博士基金项目(黔科合J字〔2014〕2153号)；凯里学院博士启动基金项目(BS201332)

蒋瑶，博士，副教授，从事生物技术等研究。E-mail:jiangyao0221@163.com