大鼠早期局灶性脑缺血再灌注损伤中USP10的表达水平变化及其与自噬的关系

方聪聪 毛善平 曾智 董慧敏 刘宝辉 王舜 谭华威

大鼠早期局灶性脑缺血再灌注损伤中USP10的表达水平变化及其与自噬的关系

方聪聪 毛善平 曾智 董慧敏 刘宝辉 王舜 谭华威

目的 探讨早期局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠模型中再灌注不同时间点USP10的表达水平变化及其与自噬的关系。方法 将36只成年雄性SD大鼠随机分成4组：假手术组、脑缺血2 h再灌注6 h模型组、脑缺血2 h再灌注12 h模型组、脑缺血2 h再灌注24 h模型组；采用线栓法致大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，给予神经行为学评分，用TTC染色法测定脑梗死体积，透射电镜观察梗死周边区皮层神经元自噬，Western blot 法检测梗死周边区皮层USP10和自噬相关蛋白LC3B的表达水平，免疫荧光双标法检测梗死周边区皮层神经元中USP10及LC3B的表达水平变化。结果 免疫荧光双标显示模型组自噬蛋白阳性细胞数与存活神经元数均于再灌注12 h最多(P<0.05)，二者某种程度上趋势一致；Western blot免疫荧光双标均显示与假手术组相比，USP10及LC3B蛋白在模型组中表达上调(P<0.01)，且于再灌注12 h组达到高峰(P<0.05)；透射电镜显示再灌注不同时间点自噬强度的变化与免疫荧光自噬蛋白表达水平的趋势基本一致。结论 早期脑I/R损伤中自噬的激活某种程度上可减轻神经元的损伤，而USP10可能通过某种机制调控脑I/R中自噬的发生发展。

脑缺血再灌注损伤 自噬 USP10 LC3

缺血性脑卒中是中国乃至全世界致残率和致死率都较高的疾病之一，其发病是由于脑血管突然闭塞(脑缺血)引起一系列病理变化，从而导致脑神经功能缺损。早期溶栓被证明是减轻神经元损伤、促进神经功能恢复最有效的方法。随着介入技术的发展，动脉内溶栓被广泛用于临床并取得了良好的效果，但研究显示缺血区恢复再灌注后脑组织损伤反而加重，出现更严重的功能障碍，且称之为脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI)[1]。减轻该损伤对早期有效治疗缺血性脑血管病和改善患者预后十分重要。

最近有研究发现再灌注期间尤其是再灌注早期机体会启动自噬(autophagy)[2-4]，通过清除损伤或多余的细胞器来修复缺氧导致的神经元损伤以及再灌注引起的继发性损伤。它被认为是新近发现的一种机体内源性神经保护现象[5]。但自噬是一把双刃剑[6]，一方面自噬的启动可能有助于维持神经元稳态，减少继发损伤，清除已经被损伤的细胞器而保护神经元；另一方面自噬的过度激活同样可以导致自噬性细胞死亡，显然这对于脑I/R中的神经元恢复非常不利。无论是缺血预处理[7]还是缺血后处理[8]诱导的神经保护作用均与自噬有着密切的关系，但是在脑缺血中自噬的水平如何决定细胞的生存与死亡尚不明确。因此，在脑I/R中研究不同时间点自噬强度的变化显得十分有必要。

USP10是哺乳动物泛素特异性蛋白酶(DUBs)的一员，能利用活性硫醇位点将泛素与靶蛋白拆开[9]，使靶蛋白泛素化障碍，阻断泛素蛋白酶体途径。有报道去泛素化酶家族DUBs中USP15[10],USP30[11]和USP35直接去泛素化Parkin的底物，下调线粒体自噬。

早期的研究报道在大鼠等多种脑缺血动物模型中都能够诱发自噬，包括全脑缺血或局灶性脑缺血以及脑缺血缺氧模型等[12-14]。也有研究证明自噬的激活与I/R损伤的减轻有关[15-16]，但其在脑I/R中作用机制尚不明确。本研究拟利用SD大鼠MCAO模型，探讨在脑I/R中不同时间点自噬强度的变化、USP10的表达水平变化及二者之间的关系，为阐明自噬参与脑I/R损伤的机制及临床研发治疗脑I/R损伤的神经保护性候选药物提供有力的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康成年雄性SD大鼠36只，体重250～300 g，来源于武汉大学人民医院动物实验中心，实验动物许可证号：SYXK(鄂) 2015-0027。

1.2 主要材料与试剂

大鼠MCAO模型尼龙线栓购于北京西浓科技有限公司；兔源性USP10、LC3B及GAPDH抗体均来自英国Abcam公司；IgG二抗(羊抗兔)来自英国Abcam公司；预染蛋白Marker购于Thermo公司；荧光二抗购于美国LICOR公司；BCA蛋白水平检测试剂盒，RIPA裂解液(强)试剂购于碧云天生；醋酸纤维素膜购于Biosharp。

1.3 方法

1.3.1 实验动物分组

将同一批健康成年SD雄性大鼠随机分为假手术组和模型组。假手术组：仅行手术及分离血管，不放线栓。模型组：将Zea longa线栓法[17]改良而建立模型。

1.3.2 大鼠大脑中动脉栓塞模型(MCAO)制备

5%异氟烷深度麻醉大鼠，取颈部正中切口，分离左侧颈外、颈内及颈总动脉，结扎并离断颈外动脉，用动脉夹夹闭颈内动脉及颈总动脉并预留一缝合线备用；在颈外动脉近颈总动脉分叉处离断颈外动脉及其周围的分支，将颈外动脉近颈动脉分叉处剪一小口，向颈内动脉缓慢插入尼龙线栓，去除颈内及颈总动脉的动脉夹，将线栓全部插入时感到有阻力，即已达到大脑中动脉的分叉处；栓塞成功后用预留的缝合线打活结扎紧线栓，缝合手术切口；阻断2 h的血流后再次麻醉大鼠，拔除线栓并结扎颈内动脉，再次缝合手术切口。

1.3.3 神经行为学评分

取材前参照Longa评分标准[18]进行神经行为学评分。模型成功的标志是大鼠麻醉苏醒后出现缺血对侧以前肢为重的偏瘫。模型纳入标准为神经行为学评分在1分以上，且大鼠断头取脑后在显微镜下查看大脑中动脉起始部略为扩张并无血管内血栓形成或出血。神经行为学参照评分，即0分：无症状；1分：提尾时损伤对侧前肢不能伸直；2分：行走时向损伤对侧旋转；3分：行走时向损伤对侧倾倒；4分：无自发活动或死亡。

1.3.4 2% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)测量脑梗死体积

异氟烷深度麻醉并处死大鼠，断头取脑，放入鼠脑专用切片模具中，沿冠状位将大脑切成2 mm的切片，将切片于TTC中浸泡30 min，恰当染色后浸于4%多聚甲醛中固定过夜，将切片按层面排列整齐并扫描[18]，使用NIH Image J软件测定大脑皮层面积及梗塞面积，通过矫正脑水肿而计算出脑组织损伤程度，即测量病灶对侧整个大脑半球面积与梗死同侧正常半球组织，梗死面积由梗塞对侧面积减去梗死同侧正常组织面积而来，再乘以切片厚度(2 mm)即为梗死体积。整个半球的梗死程度由5片大脑切片梗死体积相加而来，最后以梗死体积占对侧大脑皮层体积的百分比表示。

1.3.5 透射电镜

用2%的戊巴比妥按6 mL/Kg麻醉大鼠后用含0.5%戊二醛的4%多聚甲醛经心脏灌注固定，然后快速取脑，在冰上暴露并切取大鼠伤侧皮层约1 mm×mm×mm大小，迅速入预冷的4%戊二醛，4 ℃保存；检测前取出标本经1%饿酸固定2 h；梯度酒精、丙酮逐级脱水：50%酒精10 min→70%酒精10 min→80%丙酮10 min,2次→90%丙酮10 min，2次→无水丙酮10 min，2次→环氧树脂包埋，60 ℃温箱中聚合48 h； 切片机做超薄切片，厚度为100 nm醋酸铀，柠檬酸铅染色；透射电镜观察神经元、线粒体、溶酶体及自噬体的超微结构并拍照[18]。

1.3.6 Western blot 法检测USP10和LC3蛋白的表达水平

用生理盐水进行心脏灌注后取脑，提取脑组织蛋白，BCA法测蛋白，将组织蛋白样品与上样缓冲液(5×)按照4∶1的体积比混匀，100 ℃，5～10 min变性组织蛋白后取50 g蛋白上样，10%SDS—PAGE电泳，先70 V，40 min，然后110 V，1 h；将凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜上，用PBS洗3遍，每遍5 min；室温下5%脱脂奶粉封闭1 h；将一抗置膜于稀释的一抗中(USP10，兔源性，1∶1000；GAPDH，兔源性，1∶1 000；LC3，兔源性，1∶1 000；)，4 ℃孵育过夜，后用PBST 洗膜3次，每次5 min；然后室温下孵育二抗(羊抗兔1∶2000)2 h，先用PBST洗膜2遍，后用PBS洗膜1遍，每遍5 min，最后用Odyssey Infrared Imaging扫膜。

1.3.7 免疫荧光双标法检测USP10和LC3蛋白的表达水平

先用生理盐水再用4%的多聚甲醛快速灌注心脏后取脑，再将完整脑组织置于4%的多聚甲醛中，于4 ℃冰箱固定12 h以上；然后制成石蜡切片置于65 ℃烘箱中烘片2 h，脱蜡至水，用PBS洗3次，每次5 min；切片置于EDTA缓冲液中微波修复，中火至沸后断电，间隔10 min低火至沸；自然冷却后PBS洗3次，每次5 min；切片置于3%过氧化氢溶液中室温下避光孵育10 min；PBS洗3次，每次5 min，甩干后5% BSA封闭20 min；去除BSA液，每张切片加入约50 μL稀释的一抗覆盖组织，4 ℃过夜；PBS洗3次，每次5 min；去除PBS液，每张切片加50 μL～100 μL相应种属的二抗，37 ℃孵育50 min；PBS洗3次，每次5 min；去除PBS液，每张切片加50～100 μL DAPI染液，室温避光孵育5 min；染色后将切片放入PBS中洗3次，每次5 min；滴加适量的抗荧光淬灭剂于组织上，盖玻片封片，荧光显微镜观察拍照。

1.3.8 统计学处理

2 结 果

2.1 神经功能缺损评分的评估

假手术组大鼠无神经功能缺损，而MCAO6h组(2.33±0.81)、MCAO12h组(1.83±0.75)及MCAO24h组(2.00±0.89)分大鼠于麻醉清醒后即出现不同程度的神经功能缺损症状，如对侧前肢屈曲，右侧转圈等，但任意两组比较均无明显差异(P>0.05)。

2.2 TTC染色

如图1所示，各组均可见皮层及皮层下有明显的白色梗死灶。

2.3 透射电镜下观察自噬体的超微结构

如图2所示，各组神经元均出现异染色质核膜下边集；线粒体肿胀、嵴断裂，甚至溶解消失；初、次级溶酶体、自噬溶酶体及自噬小体形成。

2.4 Western blot法检测相关蛋白在各组中的表达水平见图3～4。

2.5 免疫荧光双标法检测梗死周边区皮层神经元中USP10和LC3蛋白的表达水平见图5～8。

图1 再灌注不同时间点脑梗死灶大小

图3 Westernblot法检测USP10和LC3蛋白在各组中的表达水平

图2 透射电镜下(×8000倍)脑缺血再灌注不同时间点溶酶体及自噬体的检测 注：→初级溶酶体，→次级溶酶体，→自噬小体，→自噬溶酶体，M为线粒体

图4 Westernblot法检测各组USP10及LC3B蛋白的表达水平 MCAO组USP10和LC3蛋白的表达明显增加(与假手术组比较，∗P<0．01)；其中MCAO12h组各蛋白表达量最高(与MCAO12h比较，△P<0．05)，而MCAO6h组与MCAO24h组各蛋白的表达水平却无明显差异(P>0．05)

3 讨 论

近20年来脑卒中始终占我国主要疾病病死率前3位，其中缺血性脑卒中占所有脑卒中的87%[20]。脑卒中发生时十分凶险，即使度过急性期，多数患者也会遗留许多后遗症。因此，如何研发有效的药物减轻CIRI、改善患者生存质量一直是该领域急需攻克的难题。

图5 免疫双标法检测缺血再灌注不同时间点神经元中USP10的表达水平变化

图6 免疫双标法检测缺血再灌注不同时间点神经元中LC3B的表达水平变化 白色箭头为目的蛋白在神经元上的阳性表达；左侧为NeuN标记神经元，右侧为merged后

图7 免疫荧光法检测缺血再灌注不同时间点神经元的数量 模型组神经元数量显著减少(与假手术组比较，∗P<0．01)，但MCAO12h组存活神经元数最多(与MCAO12h组比较，△P<0．05)

图8 免疫双标法检测缺血再灌注不同时间点神经元中USP10及LC3B的表达变化 MCAO组USP10及LC3B阳性细胞数显著增加(与假手术组比较，∗P<0．01)，但MCAO12h组USP10及LC3B阳性细胞数最多(与MCAO12h组比较，△P<0．05)

CIRI机制十分复杂，包括活性氧自由基(Reactive oxide species,ROS)、细胞内钙超载、NO失调控、兴奋性氨基酸毒性等事件。其中，ROS是CIRI的关键事件，线粒体是ROS损伤的靶器官，也是体内ROS的主要来源之一。线粒体功能紊乱与ROS过量生成/NO失调控相互作用，进一步可诱导炎症发生，从而加重神经元损伤。研究表明自噬在脑I/R中可被激活进而清除损伤的线粒体，间接清除积累的ROS,可能是治疗缺血性脑卒中的一大潜在途径[21]。

USP10是哺乳动物的泛素特异性蛋白酶(DUBs)的一员，显然可以阻断泛素蛋白酶体途径[9]。诸多研究证实缺血再灌注损伤时，泛素化蛋白质聚集，蛋白酶体活性降低[22]。同时，有研究显示去泛素化酶家族中的USP15、USP30和USP35可以下调线粒体自噬。一直以来自噬和泛素蛋白酶体都被看做是两种相互独立的蛋白降解系统，但越来越多的研究发现这两个系统内部有相互关联之处[23]。本研究发现USP10与自噬蛋白的表达趋势一致，并不难猜测USP10可能通过泛素蛋白酶体途径在CIRI中参与自噬的调节。

LC3是自噬相关的一个重要蛋白，常被作为自噬起始的标记物，也被作为检测细胞自噬程度的分子标记。LC3在细胞内主要存在两种亚型：LC3-A型和LC3-B型，LC3B在自噬的过程中始终定位于自噬体膜上[24]， LC3B含量的多少在某种程度上反映了细胞的自噬活性。本研究在假手术组内即有LC3B的低水平表达，而MCAO组LC3B蛋白表达水平自再灌注6 h起出现升高趋势，在12 h达到高峰，随后缓慢下降，差异均有统计学意义。这表明MCAO组大鼠在接受缺血缺氧刺激后机体处于应激状态并激发神经元发生自噬，且在再灌注的6 h～24 h时间段中自噬呈持续性发生。

目前国内针对自噬在脑缺血再灌注中的作用机制研究正在不断深入，但是现有的研究仍然局限于自噬到底有无保护作用以及自噬的上游调控机制等方面。本研究结果显示，脑I/R12 h存活神经元的数量最多，在一定程度上与自噬强度有关，但24 h存活神经元数却并未与自噬强度变化高度一致，本研究推测①CIRI机制十分复杂，自噬的神经保护作用不足以拯救所有方式的神经元死亡；②自噬是一把双刃剑，自噬的激活不足有可能并不能发挥神经保护作用，相反可能会导致更多神经元损伤。同时，本研究发现在脑I/R不同时间点神经元中USP10的表达水平变化均与自噬蛋白LC3B的变化高度一致。因此，本研究结果表明在早期脑I/R中自噬的激活对缺血神经元有保护作用，且与自噬强度呈现一定程度的关系；本研究推断USP10很可能参与了脑I/R中自噬的过程，并高度怀疑泛素蛋白酶体系统与自噬溶酶体途径可能在脑I/R中存在交叉调控作用。

总之，自噬在早期脑I/R中被激活并在一定程度上发挥了神经保护作用，而这种保护作用可能与自噬强度有关系；同时本研究推测USP10可能参与了早期脑I/R中的自噬过程，但具体机制还有待进一步研究。本研究注重探讨自噬与脑缺血/再灌注损伤的相互作用关系，将可能成为下一步的研究重点，并为脑缺血性疾病的治疗提供新的思路和策略。

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(2016-08-12收稿)

The study on the relation between the expression of USP10 and autophagy following early focal cerebral ischemical reperfusion injury in rats

FangCongcong,MaoShanping，ZengZhi,etal.

DepartmentofNeurology,RenminHosiptalofWuhanUniversity,Wuhan430060

Objective To explore the relation between USP10 expression and autophagy in rats model of early focal cerebral ischemia-reperfusion(I/R) injury.Methods Totally 36 male, healthy Sprague-Dawley rats were used and randomlyassigned to four groups: Sham-operated group(Sham) and cerebral ischemia-reperfusion group (MCAO6 h,12 h and 24 h group).The focal cerebral chemia-reperfusiong ( I/R) rat models were established by the middle cerebral artery occlusion (MCAO) using intraluminal suture method. The behavior scales function rats was used as a general assessment of neural of brain injury; 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) straining was used to observe infarct volume; specific structure of autophagosome and specific protein of autophagy microtubule-associated protein 1 light chain 3 B(LC3B)were detected by transmission electron microscope,WB and immunofluorescence respectively.Results Compared to the Sham group, autophagy existed in different time periods after I/R shown both in transmission electron microscope, WB and immunofluorescence, which was in line with the expression of USP10. The number of positive cells and survival neurons was significantly increased at I/R 12H compared with sham group(P<0.05) in immunofluorescence.Conclusion The intensity of autophagy was positive correlation of the number of survival neurons in rats model of early focal cerebral ischemia-reperfusion(I/R) injury. The expression of USP10 was in accord with LC3B,which indicates USP10 might regulate the development of autophagy and would lay important foundation for the study on the interaction of autophagy-lysosomes system and ubiquitin-proteasomes system in cerebral I/R injury.

Cerebral ischemia/reperfusion Autophagy USP10 LC3B

武汉市科技攻关计划项目(项目编号为2013060602010270)

430060 武汉大学人民医院神经内科[方聪聪 毛善平(通讯作者) 王舜 董慧敏]，病理科(曾智)，神经外科(刘宝辉)，精神科(谭华威)

R743.33

A

1007-0478(2017)04-0290-07

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.04.004