氧化亚氮-氧气混合吸入口腔镇静效果及对老年口腔细胞DNA损伤和糖酵解的影响

张燕升 韩 博 胡晓敏 谢培培 王嘉欣

(北京市崇文口腔医院综合治疗科，北京 100062)

氧化亚氮-氧气混合吸入口腔镇静效果及对老年口腔细胞DNA损伤和糖酵解的影响

张燕升 韩 博 胡晓敏 谢培培 王嘉欣

(北京市崇文口腔医院综合治疗科，北京 100062)

目的探讨氧化亚氮-氧气混合吸入对老年口腔镇静效果及其对口腔黏膜上皮细胞DNA损伤和糖酵解影响。方法拟行口腔颌面诊治的老年患者792例，随机分为氧化亚氮组392例和单纯局麻组400例。术前和术中记录患者心率和血氧饱和度；使用视觉模拟疼痛评分(VAS)和Ramsay法评估患者的疼痛和镇静情况。术中取牙龈黏膜，体外常规培养口腔黏膜上皮细胞，Western印迹法和细胞免疫荧光检测氧化亚氮-氧气处理不同时间细胞中γH2AX蛋白表达情况；RT-PCR检测细胞糖酵解酶基因(GLUT1、GLUT3、HK2、PK-M2)表达情况。结果单纯局麻组心率动幅较大，112例心率波动超出正常范围；氧化亚氮组术前和术中心率均在正常范围内；术中氧化亚氮组血氧饱和度高于术前和单纯局麻组(P<0.05)。氧化亚氮组术中VAS低于单纯局麻组，镇静评分高于单纯局麻组(P<0.05)。氧化亚氮-氧气处理口腔黏膜上皮细胞0.5 h后γH2AX蛋白表达明显上调，1 h达到高峰，之后逐渐降低；细胞免疫荧光检测γH2AX蛋白表达情况显示，处理2 h时荧光强度高于处理前，说明氧化亚氮-氧气诱导γH2AX表达上调，诱导细胞DNA损伤。口腔黏膜上皮细胞糖酵解基因经氧化亚氮-氧气处理后表达均上调，其中GLUT1和GLUT3基因明显上调，2 h后达到高峰，之后下降。结论氧化亚氮-氧气混合吸入配合局麻对老年口腔颌面手术患者具有较好的镇静镇痛效果；但氧化亚氮会诱导口腔黏膜上皮细胞DNA损伤，促进糖酵解，易引发术后口腔疾病，应加以预防。

氧化亚氮-氧气；镇静；口腔黏膜上皮细胞；DNA损伤；糖酵解

疼痛是口腔颌面疾病治疗中的常见问题，因口腔浅表肿物切除、复杂牙等手术时间长，损伤较大，单纯局麻难以获得理想效果〔1〕。近年来，氧化亚氮-氧气混合吸入配合局麻进行上述复杂手术逐渐在临床推广。氧化亚氮是一种对呼吸道刺激小，不损伤心、肺等重要器官且不与血红蛋白结合的安全麻醉剂。但有研究显示，氧化亚氮会影响细胞的正常生理功能，引发口腔疾病〔2〕。细胞DNA损伤早期，损伤部位组蛋白H2AX迅速磷酸化，形成γH2AX蛋白，修复DNA，而在此过程中需通过糖酵解提供能量〔3〕。本研究旨在探讨氧化亚氮-氧气混合吸入配合局麻镇静镇痛的效果及对细胞DNA损伤和糖酵解的影响。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年1～12月在北京市崇文口腔医院口腔颌面外科就诊的老年患者792例，入选标准：美国麻醉师协会(ASA)分级Ⅰ～Ⅱ级，知情同意。随机分为氧化亚氮组392例和单纯局麻组400例。氧化亚氮组中男185例，女207例，年龄60～75〔平均(65.96±5.31)〕岁。单纯局麻组男190例，女210例，年龄60～78〔平均(66.31±7.06)〕岁。两组患者性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1麻醉和评分 一氧化亚氮组将双层鼻罩置于氧化亚氮组鼻部，氧气初始流量6～8 L/min，氧化亚氮初始流量1 L/min，根据患者感觉每次可增加0.5～1 L/min，同时减少氧气流量，保持总通气量不变，观察患者意识模糊时为起效，之后使用2%利多卡因局麻后开始手术。单纯局麻组直接使用2%利多卡因局部浸润麻醉后进行手术。术中分别使用视觉模拟疼痛评分(VAS)和Ramsay法评估患者的疼痛和镇静情况。分别与术前和术中监测并记录患者心率和血氧饱和度。

1.2.2口腔黏膜上皮细胞培养 术中取牙龈黏膜，将组织块洗净后除去皮下结缔组织，剪成边长为1 mm的小块，接种到25 mm培养瓶中，加1 ml MCDB153无血清培养基，放入二氧化碳(CO2)细胞培养箱中孵育，上皮细胞布满培养皿底部时传代。吸出培养液，胰蛋白酶消化成单细胞悬液，按1×105/ml的密度接种到含10%胎牛血清(BSA)的DMEM培养基中进行传代培养。

1.2.3Western印迹检测 取对数生长期的口腔黏膜上皮细胞消化，按1×106/ml密度接种到培养瓶，孵育过夜。氧化亚氮-氧气(1∶1)混合气体处理细胞，分别培养0、0.5、1、2、4 h，RIPA裂解液提蛋白，定量、变性后上样，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯凝胶(SDS-PAGE)电泳，湿法转膜，室温下5%BSA封闭液中处理1 h，滴加一抗γH2AX(1∶500)和内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，孵育12 h，加二抗，室温孵育2 h，分析灰度值。

1.2.4细胞免疫荧光 按1×104/ml密度接种到12孔板中，设置3个复孔，常规孵育24 h。氧化亚氮-氧气(1∶1)混合气体处理细胞，培养2 h后弃去培养液，室温下4%多聚甲醛固定40 min，0.3%Triton+5%BSA破膜并封闭1 h，滴加一抗γH2AX(1∶500)孵育过夜，滴加异肽酸己二烯(DAPI)工作液染核，室温20 min，倒置显微镜下观察并拍照。

1.2.5RT-PCR检测 口腔黏膜上皮细胞按1×106/ml密度接种到6孔板中，常规培养过夜，氧化亚氮-氧气(1∶1)混合气体处理细胞，分别培养0、0.5、1、2、3 h，Trizol提取细胞总RNA，逆转录得到cDNA。反应体系20 μl(cDNA 2 μl、上游和下游引物各1 μl、SYBR Green荧光染料 10 μl、双蒸水6 μl)，常规条件下反应40个循环。引物为糖酵解相关酶基因，包括GLUT1、GLUT3、HK2、PK-M2，由武汉金开瑞生物工程有限公司合成。

1.3统计学方法 应用SPSS20.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1两组心率和血氧饱和度变化情况 单纯局麻组心率动幅较大，112例心率波动超出正常范围；氧化亚氮组术前和术中心率均在正常范围内。氧化亚氮组、单纯局麻组术前心率分别为(83.95±13.28)次/min、(84.86±13.21)次/min；术中分别为(75.92±11.05)次/min、(85.76±14.18)次/min。术中氧化亚氮组心率低于术前和单纯局麻组(P<0.05)。氧化亚氮组、单纯局麻组术前血氧饱和度分别为(99.18±2.73)ml/dl、(98.12±1.90)ml/dl；术中分别为(100.68±1.63)ml/dl、(99.49±1.85)ml/dl。术中氧化亚氮组高于术前和单纯局麻组(P<0.05)。

2.2两组疼痛和镇静评分情况 单纯局麻组术中VAS 1～5分，平均(3.72±0.83)分；氧化亚氮组术中VAS 0～2分，平均(1.65±0.42)分；两组VAS差异有统计学意义(P<0.05)。单纯局麻组术中镇静评分(1.16±0.33)分，氧化亚氮组(2.92±0.54)分；两组差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3氧化亚氮-氧气诱导口腔黏膜上皮细胞DNA损伤 处理0.5 h后γH2AX蛋白表达明显上调，1 h达到高峰，之后逐渐降低。见图1。细胞免疫荧光检测γH2AX蛋白表达情况显示，处理2 h时荧光强度高于处理前，说明氧化亚氮-氧气诱导γH2AX表达上调，诱导口腔黏膜上皮细胞DNA损伤。见图2。

2.4氧化亚氮-氧气上调口腔黏膜上皮细胞糖酵解相关酶mRNA表达 口腔黏膜上皮细胞糖酵解酶基因经氧化亚氮-氧气处理后表达均上调，其中GLUT1和GLUT3基因明显上调，2 h后达到高峰，之后下降。见表1。

表1 各时间点口腔黏膜上皮细胞糖酵解酶基因mRNA表达情况

3 讨 论

氧化亚氮-氧气混合气体吸入为个性化阵痛镇静方案，有效提升口腔治疗的舒适性，目前临床中已逐渐推广应用〔4〕。本研究结果也证实该镇痛镇静方案较单纯局麻更适用于接受口腔颌面手术的老年患者，对患者心率和血氧饱和度影响小，镇静镇痛效果明显。在细胞DNA损伤早期，损伤部位组蛋白H2AX迅速磷酸化，形成γH2AX蛋白，修复DNA。本研究说明早期细胞出现DNA损伤，随着γH2AX蛋白表达水平上述，DNA损伤逐渐被修复，但难以恢复正常水平。同时DNA修复过程需消化能量，口腔上皮细胞需通过增加糖酵解来实现〔5〕。本研究也进一步证实了γH2AX蛋白DNA损伤修复过程，通过干预手段提升糖糖酵解作用有助于患者口腔黏膜上皮细胞DNA损伤的修复。因此，临床给予老年口腔患者氧化亚氮-氧气混合气体镇静疼痛过程中应尽量避免气体进入口腔，并在术后给予促进糖酵解的药物来提升口腔黏膜上皮细胞DNA损伤的修复程度，预防术后口腔疾病的发生。

1张文文，叶保国，韩春莹，等.两种控制通气模式对老年患者喉罩麻醉下行腹腔镜手术时呼吸功能的影响〔J〕.中国老年学杂志，2012；32(2)：387-8.

2Stieglmeier M，Mooshammer M，Kitzler B,etal.Aerobic nitrous oxide production through N-nitrosating hybrid formation in ammonia-oxidizing archaea〔J〕.ISME J，2014；8(5)：1135-46.

3付建平，袁兰所，牟丽娜，等.依折麦布对高迁移率族蛋白1诱导血管内皮细胞激活的影响机制研究〔J〕.北华大学学报(自然科学版)，2017；18(1)：46-9.

4高友光，林财珠，林献忠，等.氧化亚氮复合七氟醚长时间吸入对肿瘤患者术后骨髓功能的影响〔J〕.临床麻醉学杂志，2011；27(9)：841-3.

5孙黎生.戊乙奎醚对老年口腔手术患者呼吸及循环系统的影响〔J〕.中国老年学杂志，2011；31(17)：3382-3.

〔2017-06-23修回〕

(编辑 袁左鸣)

张燕升(1975-)，男，副主任医师，主要从事口腔科研究。

R78

A

1005-9202(2017)17-4337-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.081