兔脑缺血后自噬激活与ROCK-JNK信号通路的关系

王子珍 郑传宜 杨 堃

(海南医学院第一附属医院神经外科，海南 海口 570100)

兔脑缺血后自噬激活与ROCK-JNK信号通路的关系

王子珍 郑传宜 杨 堃

(海南医学院第一附属医院神经外科，海南 海口 570100)

目的探讨脑缺血后神经元自噬激活与Rho蛋白激酶(ROCK)-C-Jun氨基酸末端激酶(JNK)信号通路的关系。方法建立蛛网膜下腔出血(SAH)后脑缺血兔脑模型，检测脑组织梗死面积确定模型是否成功。在二次注血后的不同时间处死模型，取脑缺血区域脑组织，行Western印迹检测脑组织中神经元细胞坏死、凋亡和自噬现象。通过Western印迹检测自噬抗体蛋白在兔脑模型中的表达情况。免疫组化检测脑缺血区域的自噬蛋白和ROCK-JNK信号通路蛋白的表达情况。结果采用 Longa 线栓法建立 SAH 模型成功率较高。兔脑组织中存在神经元细胞坏死、凋亡和自噬现象，模型组脑组织梗死面积相比对照组增多。Western印迹及免疫组化证实迟发型血管痉挛与神经元细胞自噬存在关联。结论脑缺血后的脑组织中存在神经元自噬现象且和ROCK-JNK信号通路存在一定关系。

脑缺血；ROCK；JNK；自噬

脑缺血后最常见也是最严重的并发症就是迟发型脑血管痉挛(DCVS)，其中约 30%可发生延迟性脑缺血神经功能障碍〔1～3〕。有研究表明，DCVS后可以激活神经元细胞自噬，通过电镜发现，在大脑皮层的神经元细胞中有自噬-溶酶体的激活〔4〕，在蛋白分子水平上也可以检测到自噬相关蛋白的表达，其中ATG5/LC3是目前公认的重要的自噬体标志物〔5〕。Beclin-1也是哺乳动物发生自噬过程中不可或缺的组分。因此，通过检测几种自噬蛋白标志物的表达可以有效表明自噬过程的存在。Rho蛋白激酶(ROCK)是丝氨酸蛋白激酶家族成员，为Rho/ROCK信号通路中的重要转导因子，也是Rho下游功能机制研究比较清楚的效应因子之一〔6〕。有研究表明Rho/ROCK信号通路可以激活C-Jun氨基酸末端激酶(JNK)的信号通路，通过激活JNK通路中的小分子GTP酶，经过信号转导调节C-jun的表达，进而调控细胞自噬功能〔7～10〕。本研究通过检测自噬蛋白和ROCK/JNK信号转导通路的蛋白表达水平，探讨DCVS后的自噬激活与ROCK/JNK信号通路的关系。

1 材料和方法

1.1兔缺血再灌注模型制作 兔购于河南医学院实验动物中心，共180只，体重2.5～3.0 kg，4～5月龄，在清洁安静的环境下饲养。采用 Longa线栓法制作缺血再灌注模型，兔脑缺血2 h后恢复再灌注。判定采用 Longa 5级标准评分法神经功能缺损评分：0分：正常，未见任何神经功能缺损的表现；1分：垂直提起时病灶对侧肢体不能伸直；2分：行走时身体向病灶对侧倾斜或旋转；3分：行走时身体向病灶对侧跌倒；4分：出现意识障碍或不能自发行走。评分为 0 分或 4 分、不明原因或明确原因提前死亡、术中出血过多、生命体征不稳定及处死时发现存在蛛网膜下腔出血(SAH)的兔模型不予采纳并随时补充。未行处理的纳入对照组。

1.2石蜡包埋及免疫组化 常规石蜡包埋兔脑组织，组织切片厚5 μm。免疫组化步骤按免疫组化S-P试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)说明书操作：载玻片脱蜡、水化，然后在枸橼酸盐缓冲液(pH6.0；Sigma)中运用微波炉抗原修复20 min，自然冷却至室温。PBS洗3次3 min，3%H2O2室温孵育15 min，PBS洗3次3 min，5%羊血清(ab7475，Abcam Company)37℃水浴30 min，一抗体(1∶100，ab14513,Abcam Company)，37℃水浴2 h，PBS洗3次3 min，辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(1∶300，北京博奥森生物技术有限公司)，PBS洗3次3 min，辣根酶标记链酶卵白素工作液(北京博奥森生物技术有限公司)37℃水浴30 min，PBS洗3 min×3次，二氨基联苯胺(DAB)显色。阴性对照用PBS代替一抗。

1.3Western印迹 裂解组织以每孔25 μg上样后行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至PVDF膜，依次加入:LC3和Beclin1单克隆抗体(稀释度1∶5 000和1∶2 000)和辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，化学荧光发光法(ECL)显影(碧云天公司)，操作过程按说明书进行。用凝胶成像系统成像对结果进行灰度扫描分析，相对表达量以相应灰度面积积分与内参的比值计算。

1.4免疫组织化学 取与痉挛血管相应的供血区兔脑组织，利用SP试剂盒行免疫组化染色，并在共聚焦显微镜下观察。选用的抗体包括ROCK、JNK、LC3及Beclin1。各组选择顶叶缺血区周围皮质作为观察部位，在高倍镜(×400)下随机取 3 个不重叠的视野拍照，利用 Image-pro plus6.0 图像分析软件分析每个视野 ROCK、JNK、LC3、Beclin1的平均光密度值。

1.5统计学方法 采用SPSS13.0行单因素方差分析，方差不齐者用Karuskal-wallis方法处理。

2 结 果

2.1兔脑缺血再灌注模型神经功能缺损评估 90只成功造模的模型兔神经功能评分：1 分 45 只，2 分 31 只，3 分 14只。行为观测：对照组一般生活情况佳，未出现明显神经功能紊乱症状；模型组栓塞动脉后2 h神经功能评价出现明显差别，一般生活情况差，精神不振、反应迟钝、食欲不佳等，神经缺损症状与体征明显。见表1。

2.2脑缺血侧皮质区梗死体积 模型组可观察到大脑皮层下出现大片梗死灶，呈白色，对照组梗死灶面积〔(11.65±1.67)%〕与模型组〔(29.37±2.89%)〕比较明显减少(P<0.05)。

2.3大脑缺血半球皮层自噬标志蛋白 LC3 和 Beclin-1 水平的

变化 对照组兔大脑缺血半球皮层 LC3的表达水平较低(0.130±0.044)。模型组兔脑缺血半球皮层 LC3 蛋白表达量明显增加(P<0.01)。Beclin-1 蛋白表达水平趋势与LC3相同，对照组表达水平较低(0.187±0.021)，模型组蛋白水平明显升高(P<0.05)。见图1。

2.4大脑缺血半球皮层ROCK-JNK自噬激活情况 ROCK在各组虽然有不同程度表达，但表达总体水平较低。模型组蛋白表达水平比对照组明显增高(P<0.05)，JNK在模型组的表达明显高于对照组(P<0.05)。LC3和Beclin-1蛋白在模型组脑组织中的表达显著高于对照组(P<0.05)。见图2。

表1 各组神经功能评分

与对照组比较：1)P<0.05

图1 兔大脑缺血半球皮层LC3 和 Beclin-1 水平的变化

图2 免疫组化法显示各组大脑缺血半球皮层ROCK-JNK自噬的激活情况(×400)

3 讨 论

有研究表明，Rho可以通过ROCK直接激活JNK，调控c-Jun的表达，但是这种调控不单单是依靠ROCK的聚合解聚作用，而是通过靶向因子的信号传导〔11～13〕。在乙二醇诱导星形细胞自噬的过程中，发现抑制Rho小分子GTP酶和ROCK激酶后，自噬细胞的肌动蛋白和肌球蛋白磷酸化后引发收缩〔14〕。因此我们考虑ROCK的激活可以调控自噬细胞的形态学变化，可以引起细胞膜发泡，进而促进巨噬细胞识别并介导自噬的发生。

在大部分真核生物体内，JNK通路是MAPKs信号通路的一种，主要介导细胞的凋亡、增殖、分化等一系列的生物学行为，而且在神经元细胞中都有表达〔15〕。有研究证明，JNK信号通路和大脑缺血再灌注之间有密切的关联〔16〕。近年来，不断有学者报道指出，JNK3和神经元细胞的自噬凋亡有一定联系，在脑卒中靶向治疗中是一个潜在有效靶点〔17〕。有研究表明，JNK的激活可以对神经元造成不可逆的损伤，在损伤30～60 min后症状最明显，且应用抑制剂可以减少其损伤程度〔18〕；而ROCK可以在自噬过程中激活JNK，加重神经元的再灌注损伤。

本实验结果表明，脑缺血后神经元细胞存在自噬现象，可能是通过ROCK-JNK双向调控激活自噬的发生。

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〔2017-02-16修回〕

(编辑 郭 菁)

TherelationshipbetweencerebralischemiaautophagyactivationwithROCK-JNKsignalingpathway

WANGZi-Zhen,ZHENGChuan-Yi,YANGKun.

DepartmentofNeurosurgery,theFirstAffiliatedHospitalofHannanMedicalCollege,Haikou570100,Hainan,China

ObjectiveTo explore the relationship between cerebral ischemia autophagy activation with ROCK-JNK signaling pathway.MethodsThe subarachnoid hemorrhage cerebral ischemic rabbit brain models were induced to test the extent of brain tissue. After double injection at different times, the rabbits were sacrificed, and brain ischemic area of brain tissue were detected by Western blot.The expressions of ROCK-JNK signaling pathway proteins were detected by immunohistochemical method.ResultsNeuronal cell necrosis, apoptosis and autophagy phenomenon were observed in rabbit brain tissues. Western blot and immunohistochemistry confirmed the association between late onset vasospasm and neuronal autophagy.ConclusionsThe neurons autophagy exists in the brain tissue after ischemia, and ROCK-JNK signaling pathway is a certain relationship with autophagy.

Cerebral ischemia; ROCK; JNK; Autophagy

国家自然科学基金(81260371)；海南省自然科学基金项目(20158300)

王子珍(1966-)，男，副主任医师，主要从事脑肿瘤及脑血管病的诊断与治疗研究。

R743.31

A

1005-9202(2017)17-4173-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.002