尿培养标本直接细菌鉴定和药敏试验的价值

王宪灵 王缚鲲 贾克然 赵会海 张海谱

·论著·

尿培养标本直接细菌鉴定和药敏试验的价值

王宪灵 王缚鲲 贾克然 赵会海 张海谱

目的探讨尿培养标本采用美华MA120系统进行细菌直接鉴定及药敏试验方法的可靠性和临床应用价值。方法住院疑似尿路感染患者送检中段尿标本835份，从中筛选出符合比对要求的标本492份，分别采用经典手工方法、常规培养法和直接方法(美华MA120系统)进行细菌鉴定和药敏试验，以经典手工方法为标准，分析直接方法细菌鉴定的正确率、未鉴定率及错误率，药敏试验的正确率、有误差率及错误率，并与常规培养法相比较。结果492份标本共检测到革兰阴性杆菌369株，革兰阳性球菌123株。常规培养法鉴定细菌的正确率为88.82% (437/492)、未鉴定率为6.91%(34/492)、错误率为4.27%(21/492)；直接法鉴定的正确率为85.37%(420/492)、未鉴定率为10.16%(50/492)、错误率为4.47%(22/492)，两种方法细菌鉴定结果差异无统计学意义(P>0.05)。常规培养法与直接法的革兰阴性杆菌的药敏试验正确率分别为94.04%和93.13%，有误差率分别为4.12%和4.01%，差异无统计学意义(P>0.05)，但常规培养法的平均错误率1.84%明显低于直接方法的平均错误率2.85%，差异有统计学意义(P<0.05)。常规培养法与直接法的革兰阳性球菌的药敏试验正确率分别为92.89%和86.79%，有误差率分别为5.39%和9.65%，错误率分别为1.73%和3.56%，差异有统计学意义(P<0.05)。结论应用美华MA120对尿培养标本进行直接鉴定及药敏试验时，细菌鉴定及革兰阴性杆菌的药敏试验结果比较可靠，可以为临床合理使用抗菌药物提供参考依据，但革兰阳性球菌的药敏结果的可靠性有待进一步论证。

尿培养；直接细菌鉴定；药敏试验

尿路感染(urinary tract infection，UTI)是临床常见感染性疾病之一，抗菌药物使用中很大部分用于治疗UTI。经验性推荐使用治疗UTI的抗菌药物，一般需要满足耐药率低于10%的要求，但卫生部细菌耐药监测结果显示：除呋喃妥因外没有其他能够满足需要的广谱抗生素用于治疗UTI。由于常规培养和药敏方法耗时较长，不能及时报告细菌耐药结果，一方面造成无效治疗，另一方面增加患者负担，造成疾病迁延不愈。因此早期识别UTI的病原菌以及药敏结果可以明显提高治愈率，并且降低患者药品、实验室检查等费用。近年来，随着细菌自动化鉴定和药敏分析系统的发展，大部分细菌的鉴定和药敏分析结果可以在2～12 h内得到，而且有很高的准确性。将尿培养标本直接用自动化鉴定和药敏系统进行细菌鉴定和药敏试验在国外已有研究，并取得一定结果[1]。本研究中，我们利用美华MA120型自动化细菌鉴定和药敏系统及其配套测试卡对尿培养标本进行直接细菌鉴定及药敏试验的研究，并和常规方法比较，探讨该方法的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1一般资料2014年1月至2015年12月在我院住院疑似USI患者送检中段尿培养标本835份。所有标本为晨起留取中段尿，尿常规检测(UF1000)白细胞数≥500 WBC/μl，2 h内送检。患者男212例，女623例；年龄3～87岁，平均60.4岁。

1.2仪器与试剂珠海美华生物科技公司MA120型细菌鉴定和药敏分析系统及其配套检测板，细菌鉴定试剂购自杭州天和生物制品公司，血基础培养基为英国Oxoid公司产品；质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923，购自中国工业微生物菌种保藏中心。

1.3方法

1.3.1标本筛选与预处理:参考文献[1]中的方法首先对标本进行筛选。取中段尿标本5 ml加入无菌离心管中，1 000 g/min离心1 min，上清转移至另一无菌离心管中，10 000 g/min离心10 min，弃去上清留底部约留50 μl打散，用10 μl接种环取菌液加在玻片上自然干燥，固定后染色镜检，根据染色结果确定进行下一步实验的标本。经筛选共有302份标本不符合要求，未进行下一步实验，其中镜检大于1种细菌的115份(38.08%)，检测为酵母菌的27份(8.9%)，未检测到细菌或细菌数目小于30个/油镜视野的137份(45.36%),样本量少不适于实验的23份(7.62%)。其他533份标本初步筛选合乎要求可以进行下一步实验。

1.3.2经典手工方法和常规培养方法:经典手工方法参考临床检验操作规程进行常规尿细菌培养和鉴定，并利用琼脂扩散法进行药物敏感试验。常规培养法为取尿液定量接种于普通血平板及巧克力平板，在35℃二氧化碳培养箱培养18～24 h形成菌落后，首先进行细菌定量，对≥103/ml的样本进行鉴定和药敏试验。根据细菌菌落革兰染色结果，革兰阳性菌进行触媒试验，触媒试验阳性球菌利用葡萄球菌板，触媒试验阴性球菌利用链/肠球菌板，进行相应的鉴定和药敏试验；革兰阴性菌接种克氏双糖管，根据实验结果选择肠杆菌鉴定板或非发酵菌鉴定板进行相应的鉴定和药敏试验。

1.3.3直接细菌鉴定和药敏方法:取离心后的菌液根据要求制备0.5～1.0 McF菌液，以无菌滴管吸取少量菌液，依据1.3.1的革兰染色结果，阳性菌进行触媒试验，触媒试验阳性球菌利用葡萄球菌鉴定板，触媒试验阴性球菌利用链/肠球菌鉴定板，进行相应的鉴定和药敏试验；革兰阴性菌进行氧化酶试验，氧化酶试验阴性杆菌利用非发酵菌鉴定板，氧化酶试验阳性杆菌利用肠杆菌鉴定板，进行相应的鉴定和药敏试验；革兰阳性菌温箱孵育24 h、革兰阴性菌温箱孵育8 h后取出进行细菌鉴定和药敏分析。

1.4统计学分析533份标本经培养检测，其中32份标本有2中以上细菌生长，9份标本无细菌生长，不适宜进行对比分析，实际进行统计分析的标本为492份。以经典手工方法为标准，分析应用美华MA120型自动化细菌鉴定和药敏系统对尿培养阳性标本进行常规培养和直接细菌鉴定的准确率，并比较两种方法的差异；药敏试验的结果分为3种，正确、有误差和错误，分析并比较常规培养和直接药敏试验的正确率。由于革兰阴性杆菌和革兰阳性球菌所做的药物敏感试验差异较大，所以分别进行统计分析。所有统计分析利用SPSS 13.0软件完成，两者比较采用χ2检验或Fisher精确检验，P<0.05为差异有统计学意义。见表1。

表1 药敏试验结果判断定义表

注：R:耐药；I：中介；S：敏感

2 结果

2.1 492例尿培养标本的细菌鉴定结果492例尿培养阳性标本共检测到革兰阴性杆菌369株，革兰阳性球菌123株，检出最多的分别是大肠埃希菌278株(56.50%)，表皮葡萄球菌42株(8.54%)、屎肠球菌31株(6.30%)、肺炎克雷伯菌27株(5.49%)、粪肠球菌26株(5.28%)，奇异变形杆菌23株(4.67%)。采用常规培养法细菌鉴定的正确率为88.82%(437/492)、未鉴定率为6.91%(34/492)、鉴定错误率为4.27%(21/492)；采用直接法鉴定的正确率为85.37%(420/492)、未鉴定率为10.16%(50/492)鉴定错误率为4.47%(22/492)，两种方法细菌鉴定结果差异无统计学意义(χ2=2.613,P=0.106; χ2=3.332,P=0.068;χ2=0.024,P=0.876)。检出最多的大肠埃希菌和表皮葡萄球菌常规培养法鉴定的正确率分别为85.25%(237/278)和97.62%(41/42)，与采用直接法鉴定的正确率84.17%(234/278)和90.48%(38/42)相比差异无统计学意义(χ2=0.125,P=0.724；F=0.360)。其他细菌由于例数较少未做统计分析。见表2。

2.2革兰阴性杆菌药敏结果分析以经典手工法为标准，分析采用常规培养法所鉴定的369株革兰阴性杆菌对15种常用抗生素的药敏试验结果，其平均正确率94.04%、有误差率4.12%与采用直接法的平均正确率93.13%、有误差率4.01%相比差异无统计学意义(χ2=3.76,P=0.05;χ2=0.83,P=0.77)，但常规培养法的平均错误率1.84%明显低于直接法的平均错误率2.85%,差异有统计学意义(χ2=12.35,P=0.00)。单种抗生素的药敏分析结果表明两种方法对所有369株革兰阴性杆菌检测的药敏结果正确率均无明显差异(P>0.05)。见表3。

2.3革兰阳性球菌药敏分析结果以经典手工法为标准，分析采用常规培养法所鉴定的123株革兰阳性球菌对16种常用抗生素的药敏试验结果，其平均正确率92.89%、有误差率5.39%、错误率1.73%，与采用直接法的平均正确率86.79%、有误差率9.65%、错误率3.56%相比差异有统计学意义(χ2值分别为40.07、25.78、12.80,P<0.05)。常规培养法与直接方法的多西环素正确率分别为100%和94.31%，克林霉素正确率分别为91.87%和77.24%，克拉霉素正确率分别为91.06%和73.98，两种方法比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

3 讨论

尿路感染治疗最重要的是选择有效的抗菌药物，合理使用抗菌药物，可以有效减少尿路感染患者住院天数，改善患者预后，减少治疗费用[2-4]。由于常规培

表2 492例标本两种方法细菌鉴定结果比较 份

注：与常规方法比较，*P<0.05

表3 369株革兰阴性杆菌药敏分析结果 份(%)

注：与常规培养法比较，*P<0.05

表4 123株革兰阳性球菌药敏分析结果 份(%)

注：与常规方法比较，*P<0.05

养法耗时较长，通常在药敏结果报告前，临床都是依靠经验选择用药。针对尿路感染推荐的经验性抗感染药物，一般需要满足耐药率低于10%的要求，但卫生部细菌耐药监测结果显示：除呋喃妥因外没有其他能够满足需要的广谱抗生素用于治疗尿路感染[5,6]。而我们所做的研究显示在肾盂肾炎患者中依靠经验应用抗菌药物总的有效率仅为64.1%[7],这表明依靠经验用药所用抗菌药物许多都是无效用药，延误了患者治疗，造成患者经济损失和医疗资源的巨大浪费。因此早期识别尿路感染中的病原菌以及药敏结果有重要意义。采用尿液标本直接进行细菌鉴定和药敏试验，可以在8～24 h内得到结果，极大缩短了检测时间。虽然NCCLS未推荐尿液标本进行直接药敏试验，但国外的研究表明，采用自动化仪器对尿液标本进行鉴定和药敏试验，检测结果可靠，并取得良好应用效果[1]。本研究利用美华MA120型自动化细菌鉴定和药敏系统及其配套测试卡对尿液标本进行直接鉴定及药敏试验，可以极大缩短检测时间，有很大的临床应用价值。

本研究对492例尿培养阳性标本进行鉴定和药敏试验，直接法鉴定的正确率85.37%与常规培养法的正确率88.82%比较无明显差异。药敏结果表明，采用直接法的平均正确率93.13%与常规培养法的平均正确率94.04%相比无明显差异。单种抗生素的药敏分析结果表明，两种方法对所有369株革兰阴性杆菌的药敏结果正确率均无明显差异。采用常规培养法的革兰氏阳性球菌药敏结果平均正确率92.89%明显高于采用直接方法的平均正确率86.79%，差异显著。分析直接法革兰阳性球菌药敏试验平均正确率较低的原因，是因为有几种抗生素的正确率直接法明显低于常规培养法。单种抗生素的药敏分析结果表明，革兰氏阳性球菌对多西环素、克林霉素、克拉霉素的药敏试验两种方法比较正确率有差异。分析多西环素、克林霉素、克拉霉素错误率较高的原因第一可能是细菌鉴定和药敏系统本身的原因，这几种药物的敏感性和稳定性存在差异；第二可能是细菌方面的原因，因为出现错误的多为具有生长较慢、生化特征不明显、难以鉴定等特点的细菌，本身鉴定比较困难。国外相关研究表明，尿液培养标本直接细菌鉴定正确率为82.3%[1]。药敏试验正确率为84.7%，本研究中革兰阳性球菌虽然直接法药敏正确率低于常规方法，但仍高达86.79%，表明本系统的鉴定和药敏结果可以接受，可被临床参考应用。

本研究应用国产自动化细菌鉴定和药敏系统对筛选的尿液培养标本进行直接鉴定药敏试验，革兰阴性杆菌选在8 h测定结果，因为大多革兰阴性杆菌生长迅速，8 h测定不影响结果，而且也可以在实验当天将结果报告临床医生方便医生调整用药；革兰阳性球菌选在24 h后测定，是因为研究中发现，本系统对大部分阳性球菌10 h内进行测定所得的结果不准确，因为大部分阳性球菌在本系统生长较慢，需要培养过夜才能得到可靠结果，但这也比常规实验先得到纯菌落再进行试验大大缩短了时间，对临床具有积极意义。与国外相关系统比较[8]，革兰阳性球菌直接鉴定药敏实验检测时间较长，需要进一步提高，而且在几种特殊抗生素的的药敏试验中正确率较低，需要特别注意。综上所述，应用国产自动化细菌鉴定和药敏系统对尿液标本进行直接鉴定药敏试验，结果可靠，快速，经济，可以为临床合理使用抗菌药物提供及时、可靠的帮助。

1 MunozDavila MJ,Roig M,Yague G,et al.Comparative evaluation of vitek 2 identification and susceptibility testing of urinary tract pathogens directly and isolated from chromogenic media.Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2013,32:773-780.

2 付陈超.合理使用抗菌药物减少泌尿道感染患者住院天数.中国感染控制杂志，2014,13:35.

3 Dong T,Zhao X.Rapid identification and susceptibility testing of uropathogenic microbes via immunosorbent ATP-bioluminescence assay on a microfluidic simulator for antibiotic therapy.Anal Chem,2015,87:2410-2418.

4 Sigler M,Leal JE,Bliven K,et al.Assessment of appropriate antibiotic prescribing for urinary tract infections in an internal medicine clinic.Southern medical journal,2015,108:300-304.

5 齐慧敏,吕媛.卫生部全国细菌耐药监测网2011年女性尿标本来源细菌耐药监测.中国临床药理学杂志,2012,28:899-904.

6 郑波,吕媛.卫生部全国细菌耐药监测网2011年男性尿标本来源细菌耐药监测.中国临床药理学杂志,2012,28:893-898.

7 张海谱,梁霞,贾克然,等.肾盂肾炎患者经验用抗菌药物与药敏结果的符合率.中国感染控制杂志,2016,15:22-25.

8 保勇,史梦,杨永长,等.血培养直接药敏试验对感染性疾病的诊疗价值.实用医院临床杂志,2013,10:107-109.

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.18.036

050082 石家庄市，中国人民解放军白求恩国际和平医院检验实验科

张海谱,050082 石家庄市，中国人民解放军白求恩国际和平医院检验实验科;

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1002-7386(2017)18-2848-04

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