基质金属蛋白酶-9基因多态性与缺血性脑卒中的相关性☆

钟望涛陈建雅方健斌彭尧群刘思序李友崔理立赵斌

·论 著·

基质金属蛋白酶-9基因多态性与缺血性脑卒中的相关性☆

钟望涛*陈建雅*方健斌*彭尧群*刘思序*李友**崔理立**赵斌**

目的探讨基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9,MMP-9）基因多态性与缺血性脑卒中的相关性。方法运用多重小测序技术（multiplex SNaPshot）分析粤西地区251例缺血性脑卒中患者和96例健康对照组MMP-9基因（rs3787268、rs3918241、rs3918242）的多态性分布，并分析与缺血性脑卒中的相关性。结果①与对照组相比，病例组rs3787268基因型频率有统计学差异（P=0.042），在隐性模型中A/A基因型的个体患病风险升高（OR=2.21，P=0.046）；②rs3918242基因型频率亦有统计学差异（P=0.007），在显性模型中，携带T基因型的个体患病风险升高（OR=2.14，P=0.009）；③其中rs3787268在大动脉粥样硬化（large artery atherosclerosis，LAA）亚型组的基因型分布与对照组相比有统计学差异（P=0.039），而非LAA亚型中无统计学差异；rs3918242在LAA亚型组的基因型和等位基因频率与对照组相比分别有统计学差异（P=0.009，P=0.047），在非LAA亚型中无统计学差异。结论MMP-9基因rs3787268和rs3918242多态位点突变可能与中国粤西地区汉族人群缺血性脑卒中的发病风险相关；并主要可能增加了LAA型脑卒中的发病风险。

基质金属蛋白酶-9动脉粥样硬化 缺血性脑卒中 单核苷酸多态性

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是以进行性脂质沉积、纤维组织增生和炎性细胞浸润为特征的累及全身大、中型弹性和肌性动脉的慢性疾病，是导致冠心病、脑梗死、腹主动脉瘤等疾病的共同病理基础[1]。近年来发现，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）参与了AS形成机制中的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)降解及重构。RAO等[2]发现，MMP-9 mRNA在颈动脉斑块平滑肌细胞中表达明显增多。ZHANG[3]研究表明MMP-9的基因启动子区SNP（rs3918242）可以调控基因转录，多个SNP如rs17576、rs3918241与AS密切相关[4]。但少见与脑卒中的相关性研究报告，基因连锁分析显示（rs3787268、rs3918241、rs3918242）3位点共存于启动子连锁区，因此我们在251例缺血性脑卒中患者和96例对照组中分析了3位点的基因多态性与缺血性脑卒中的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象广东医科大学医学伦理委员会批准本研究计划并获得研究对象签署知情同意书。选择广东医科大学附属医院神经内科住院病房的患者251例（病例组）和96例（对照组）为研究对象，研究对象来源于粤西地区的汉族人群。①病例组：入组标准：a.符合缺血性脑卒中诊断标准[5]；b.经磁共振成像和（或）CT确诊为缺血性脑卒中；c.全部患者行脑血管造影（DSA）。排除标准：a.有冠心病与外周血管疾病病史；b.合并自身免疫疾病；c.合并严重感染性疾病；d.颅内感染、癫痫等中枢神经系统疾病；e.严重肝肾功能不全。②对照组：均来源于广东医科大学附属医院神经内科住院病房，经头颅MRA与颈部CTA/颈动脉彩超等排除脑梗死与颅脑血管狭窄性疾病，排除冠心病、外周血管疾病、肝肾疾病、自身免疫性疾病、感染、恶性肿瘤等疾病患者。

1.2 研究方法

1.2.1 一般资料收集 本实验研究对象所收录的信息包括：性别、年龄、总胆固醇（total cholesterol，CHOL）、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL-C)、高密度脂蛋白( high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、空腹血糖、糖化血红蛋白、吸烟、高血压、同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)等。

1.2.2 血标本采集 使用 TIANamp Blood DNA Kit按说明方案从外周血提取DNA（北京天根生物工程有限公司）。

1.2.3 病例组分型 根据中国缺血性卒中亚型（Chinese ischemic stroke subclassification，CISS）[6]分类进行分型：①大动脉粥样硬化 （large artery atherosclerosis，LAA）；②心源性卒中型（cardiogenic stroke，CS）；③穿支动脉疾病 （penetrating artery disease，PAD）；④其他病因（other etiologies，OE）；⑤病因不确定（undetermined etiology，UE）。

1.3 聚合酶链式反应（PCR）

1.3.1 PCR引物设计：在线Primer3软件设计多重PCR扩增的上下游引物（rs3787268：ATCCTGGGC CATAGAGGATG/TCCTCACTCAGCCTCCCTTrs3918 241：TCGTGACTGCAAAGCAGATG/AATGAGACTG TGAGATGGAG；rs3918242：CCTCCCGAGTAGCTGG TAT/CCTGGTCAACGTAGTGAAAC）。

1.3.2 多重PCR反应体系 1.0 μL DNA模板，2.0 μL 1 U HotStarTaq polymerase(Qiagen Inc.)，2.0 μL 0.3 mM dNTP，1.0 μL多重PCR引物，2.0 μL 3.0 mM Mg2+，2.0 μL 1X HotStarTaq buffer，总体积10.0 μL。

1.3.3 PCR循环条件及程序 95℃ 2 min 11个循环 (94℃ 20 s,65℃ 5 s/每循环40 s,72℃ 1.5 min)；24个循环(94℃ 20 s,59℃ 30 s,72℃ 1.5 min)；72℃ 2 min；4℃ 保存。

1.3.4 所得产物纯化 在15 μL PCR产物中加入5 U虾碱酶（SAP）和2 U Exonuclease I酶，然后37℃温浴1 h，再75℃灭活15 min。

1.4 SNaPshot SNP分型技术

1.4.1 引物延伸 利用在线Primer 3软件设计单碱基延伸引物（rs3787268SR：TTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTAGAGGATGTCGCTTAAAAC；rs39182 41SR：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAACTTTTCTGTAA AGGAAG；rs3918242SR：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTCGAGTAGCTGGTATTATAGGCG CGTACTTGT）。

1.4.2 延伸反应体系包括 5.0 μL SNaPshot Multiplex Kit(ABI)，2.0 μL纯化后多重PCR产物，1.0 μL延伸引物混合物，2.0 μL超纯水。

1.4.3 循环程序 96℃1 min;28个循环 (96℃10 s, 52℃5 s,60℃30 s);4℃保存。

1.4.4 延伸产物纯化 在10 μL延伸产物中加入1U SAP酶，37℃温浴1 h,然后75℃灭活15 min。

1.4.5 延伸产物上ABI3130XL测序仪 取0.5 μL纯化后的延伸产物，与0.5μLLiz120SIZESTANDARD，9 μL Hi-Di混匀，95℃变性 5 min后上ABI3130XL测序仪。

1.4.6 ABI3130XL测序仪上收集的原始数据用GeneMapper 4.1 (AppliedBiosystems Co.Ltd.USA)来分析。

1.5 统计学方法采用SPSS17.0软件进行统计分析。临床计量资料以(±s)表示，两组间比较采用两样本的t检验（数据符合正态分布），数据不符合正态分布的多组间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验；计数资料以百分比表示，两组间比较采用Pearson’s χ2检验。χ2检验比较各组间的基因型、等位基因频率差异。Logistic回归分析缺血性脑卒中相关危险因素。使用Haploview 4.1软件构建单体型。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 临床资料对比病例组的相关危险因素如吸烟、高血压、血糖、TG和HCY等与对照组相比，有显著统计学差异；HDL-C水平作为缺血性脑卒中保护因素则有意义地低于对照组；两组的LDLC、CHOL水平无统计学差异（表1）。

2.2 MMP-9基因多态性分析缺血性脑卒中组与对照组 MMP-9基因的 rs3787268，rs3918241，rs3918242位点各基因型和等位基因频率经Hardy-Weinberg平衡检验，所有基因型和等位基因分布均符合基因分析要求。病例组251例患者进行亚组分析分类其中LAA组210例，PAD组31例，另外10例包括3例心源性卒中，4例不明原因卒中，3例其他病因卒中，因为在本组病例组中数量太少，亚组分析中予以省略。

rs3787268各基因型频率与对照组相比有显著性差异（P=0.042），而在隐性模型中，与G/G+G/ A基因型的个体相比，A/A基因型的个体患病风险升高（OR=2.21，P=0.046）（表2）。

与对照组相比rs3918242各基因型与等位基因频率分别有显著性差异（P=0.007，P=0.038）。而在显性模型中，与C/C基因型的个体相比，携带T基因型的个体患病风险升高 （OR=2.14，P=0.009）（表3）。

rs3918241三种基因型频率 (T/T、A/T、A/A)和等位基因频率（T，A）与对照组比较差异无显著性（表4）故未在缺血性脑卒中亚型中比较分析。

表1 病例组与对照组的临床资料

表2 rs3787268 SNPs基因多态性与缺血性脑卒中及亚型相关性分析

2.3MMP-9基因的 SNPs单体型分析使用Haploview软件对rs3787268，rs3918241，rs3918242位点进行连锁不平衡分析，计算连锁不平衡系数D':0.14,r:0.002。以连锁不平衡 （linkage disequilibrium，LD）系数D'＞0.8为强连锁标准，结果表明三位点不存在连锁不平衡，无法获得有效的单倍体重构。

2.4 Logistic回归矫正危险因素后分析在对缺血性脑卒中的相关的危险因素如：年龄、性别、吸烟史、高血压病史、血糖、糖化血红蛋白、TG、CHOL、HDL-C、LDL-C、HCY、rs3787268、rs3918241 和rs3918242，采用逐步Logistic回归法，按a入=0.05，а出=0.10原则，将上述入选的危险因素引入多因素Logistic回归模型。结果提示吸烟、高血压、血糖、高HCY是缺血性脑卒中的独立危险因素，s3787268、rs3918241和rs3918242并未显示出有意义相关性。

2.5 MMP-9基因rs3787268、rs3918242与CISS亚型相关性分析根据CISS标准将缺血性脑卒中分型后，rs3787268多态在LAA亚型组的基因型分布与对照组相比有统计学差异（P=0.039），同样在隐性模型中，与G/G+G/A基因型的个体相比，A/A基因型的个体患病风险升高 （OR=3.47，P= 0.042）；等位基因频率与对照组相比无统计学差异。而其他亚型的基因型、等位基因频率与对照组比较均无统计学差异，心源性卒中型（cardiogenic stroke，CS）与病因不确定型（undetermined etiology，UE）病例数太少未予列出（表2）。rs3918242多态在LAA亚型组的基因型、等位基因频率与对照组相比分别均有统计学差异（P=0.009，P=0.047），而在显性模型中，与C/C基因型的个体相比，携带T基因型的个体患病风险升高（OR=6.44，P=0.011）。而其他亚型的基因型分布、等位基因频率与对照组比较均无统计学差异（表3）。

3 讨论

表3 rs3918242 SNPs基因多态性与缺血性脑卒中及亚型相关性分析

表4 rs3918241 SNPs基因多态性与缺血性脑卒中及亚型相关性分析

MMP-9主要参与细胞外基质 （ECM）的降解及重构，对保持血管内皮的稳定性和完整性起着重要作用[7]。脑梗死发病时组织缺血缺氧作为一种信号刺激内皮细胞、炎症细胞、神经元和胶质细胞等激活MMPs系统，可致MMPs表达增加，尤其是MMP-9在缺血脑组织中明显增高且与梗死体积相关[8-9]。ZHANG等[3]发现，rs3918242（-1562C/T）位点C→T后，产出低活性（C/C）和高活性（C/T、T/ T）的启动子基因型，而高活性型可致MMP-9表达增高。本研究显示，缺血性脑卒中组rs3918242的各基因型频率、等位基因频率与对照组相比有显著性差异，而在显性模型中，与CC纯合子相比，携带T基因型的个体患病风险显著升高（OR= 2.14，P=0.009）；进一步亦在LAA亚型中显示出明显相关性，提示rs3918242位点与大动脉粥样硬化型缺血性脑卒中遗传易感性相关，与国内其他研究报道相一致[10-11]。另一位点rs3787268位于内含子区。本研究发现，缺血性脑卒中组rs3787268的各基因型频率与对照组相比有统计学差异，进一步在隐性模型中，与G/G+G/A基因型个体相比，A/A纯合子患病风险升高 （OR=2.21，P=0.046），同样在LAA亚型中这种趋势更为明显 （OR=3.47，P= 0.042），提示rs3787268多态亦与大动脉粥样硬化型缺血性脑卒中遗传易感性相关。SNPs单体型分析发现三位点不存在连锁不平衡，无法获得有效的单倍体重构；同时，多因素Logistic回归模型结果提示吸烟、高血压、血糖、高HCY仍是缺血性脑卒中传统上的独立危险因素，rs3787268、rs3918241和rs3918242并未显示出有意义相关性，提示MMP-9基因可能只是一定程度上微弱增加了缺血性脑卒中的发病风险。本研究病例组患者全部经DSA造影确认并根据CISS分类进行分型，发现rs3787268和rs3918242的阳性结果仅表现在LAA亚型中，提示两者可能调控组织MMP-9表达并影响细胞外基质（ECM）降解及重构，参与颅脑大动脉粥样硬化病理进程，RAO等[2]发现证实这一假说，具体机制有待深入探索。另外尽管两组人群存在明显性别比例差异，但在性别分层比较后可以消除这一偏倚。总之，本研究进一步证实MMP-9基因rs3787268和rs3918242多态位点与中国粤西地区汉族人群缺血性脑卒中的发病风险相关，并主要可能增加大动脉粥样硬化型脑卒中的发病风险。同时由于本研究局限于中国南方汉族人群，样本量偏小，有必要扩大样本量或在其他种族人群中进一步研究。

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An association study between matrix metalloproteinase-9 gene polymorphisms and ischemic stroke.

ZHONG Wangtao,CHEN Jianya,FANG Jianbin,PENG Yaoqun,LIU Sixu,LI You,CUI Lili,ZHAO Bin.The Affiliated Hospital of Guangdong Medical University,Zhanjiang,524001,China.Tel:0759-2387322.

ObjectiveObjective TO investigate the potential association between matrix metalloproteinase-9 (MMP-9)gene polymorphisms and risk of ischemic stroke in Western Guangdong population.MethodsThis hospitalbased case-control study recruited 251 patients with ischemic stroke and 96 controls.Using Multiplex SNaPshot method was used to detect the genotype of MMP-9 gene rs3787268、rs3918241 and rs3918242 polymorphisms.The association between MMP-9 gene polymorphisms and risk of ischemic stroke was analyzed.Results① There were significant differences in the genotype distribution of rs3787268 between ischemic stroke group and the controls(P= 0.042).In the recessive model,the individual risk of A/A genotype was higher(OR=2.21,P=0.046)than that of the G/G+G/A genotype.② Compared with the controls,the genotype and allele distribution of rs3918242 in the ischemic stroke group were significantly different(P=0.007,P=0.038).In the dominant model,the risk of individuals carrying the T genotype was significantly elevated(OR=2.14,P=0.009)compared with individuals with the C/C genotype.③The genotype distribution of rs3787268 polymorphisms in the LAA but not in no-LAA subgroup was significantly different from that in the controls (P=0.039).The genotype distribution and allele frequency of rs3918242polymorphisms in the LAA subgroup were significantly different from that of the control group (P=0.009,P=0.047). There was no significant difference in the genotype distribution and allele frequency between no-LAA subtype and the control group.ConclusionsThe MMP-9 gene rs3918242 and rs3787268 polymorphisms may be the risk factors of ischemic stroke in Han population in the western part of Guangdong province，China.The MMP-9 gene rs3918242 and rs3787268 polymorphisms may be the risk factors of large-artery atherosclerotic stroke.

Matrix metalloproteinases-9 Atherosclerosis Ischemic stroke Single nucleotide polymorphism

R743.31

A

2016-12-16）

（责任编辑：李立）

10.3969/j.issn.1002-0152.2017.07.006

☆国家自然科学基金资助项目（编号：81404061）

* 广东医科大学附属医院神经内科（湛江 524001）

**广东医科大学附属医院神经病学研究所