生物低温在生物样本库中的应用

张园园，李灵溪（金西盟低温生物研究院，国际低温生物协会，北京 100070）

欧美已经有很多大规模的样本库，而生物样本库近几年在中国也开展得如火如荼。随着生物和医学技术的快速发展，建立一个专业、高效及管理有序的生物样本库以存储和利用人类丰富的样本资源已成为众多国家保存人类遗传多样性的重要方式。

而生物低温在样本库中的应用非常广泛。低温生物学是研究低温对生物体所产生的影响及其应用的学科，样本通过在低温环境下长期存储，在被需要时可以得到很好地复苏，从而实现储存样本的应用意义。本文针对生物低温在样本库中的应用进行了介绍。

生物样本库是指一个集中保存用于疾病的临床治疗和生命科学研究的各种人类生物材料的生物应用系统。生物样本库涉及的样本类型及相关信息主要包括健康和疾病生物体的生物大分子、细胞、组织和器官等。根据存储的样本类型，生物样本库可分为基因库、细胞库、组织库及器官库等［1］。

生物样本库按照其流程及功能，通常分为3个部分：样品处理、样品存储及样本库的信息化管理。

1 生物低温在样本处理中的应用

迄今为止，人们采用的低温保存方法都是将细胞或组织置于含抗冻剂的水溶液中进行降温和复温。在细胞内部也富含多组分的水溶液，因此，研究在冷冻过程中细胞内部的变化以及抗冻剂在此过程中的作用为样本处理提供了强有力的保障。

真正实现低温保存是在1949年，当时生物学家在偶然的情况下发现加甘油的精子可以经历低温而不死亡［2］。在1980年，科学家就发现红细胞在液氮温度下保存12年复温后，没有发生任何生化和功能上的差异，从而在实践上证明了生物材料可以在低温下长期存活，但生物体在降温和复温过程中极易遭受损伤而死亡。此过程中包括3个主要的物理化学过程，即液体溶液的固化过程、固化溶液的融化过程和水分通过细胞膜的渗透过程。由此引起的溶液冰晶形成和生长、冰晶的再结晶、高渗压应力和溶液的高浓度毒性等因素均会损伤细胞。因此，若不进行特殊的控制，绝大多数生物体在经历低温和复温时会因损伤而死亡［3-4］。

不同的生物体要求不同的低温处理程序，包括在保存溶液中加入和取走某些特殊的抗冻剂和特殊的降温、复温程序。目前，人们已经能够将人体血液、精子、胚胎、胰岛、角膜、皮肤、甲状旁腺、白细胞及骨髓细胞等成功进行低温保存，但是基本都是简单的细胞，组织保存也是保存其中最主要的细胞，而对于更为复杂的细胞、组织和器官，甚至是人体等实现低温保存，还需要更深入地研究低温损伤机制，采用新的技术，探索新的保存程序。就如近期出现的国内首例人体冻存的例子，1例49岁的癌症患者死亡后，其遗体被程序降温并用液氮冻存。这个案例在国内引起了很大的轰动，但据中科院专家表示，就目前的技术而言，冻存器官还未成功，冻存遗体可能很难实现。至于50年后，甚至100年后，该例患者是否会成功复活，却为我们画了一个问号，也需要行业人士继续对人体的冻存和复苏有更加深入的研究。

1.1 低温保存的两种方法

1.1.1 慢速冷却低温保存法：到目前为止，成功的低温保存大多采用“慢速冷却”法，即程序降温法。其具体步骤如下：先将细胞放在含有抗冻剂的溶液中进行预处理，接着用程序降温仪将上述细胞连同溶液以较慢的速度降温；细胞外溶液中的水分结冰使溶液的浓度升高，胞内的水分透过细胞膜向外渗出，细胞体积收缩，胞内液体浓度提高；随着温度的下降，上述过程继续进行；到一定的低温时，再快速降温至液氮温度，并长期保存在此温度下。

在这种慢速冷冻过程中，不同的细胞要求不同的最佳降温速率。若降温速度过快，则在胞内形成冰晶，这些胞内冰晶在复温过程中会再结晶而使细胞受损；若降温速率过慢，则细胞收缩过剧，细胞处在高浓度溶液中的时间过长引起损伤，这个过程是传热和渗透两个因素的相互作用。最佳冷却速率是指这两个因素达到最好的配合［5］。不同类型细胞所需的冷却速率也会有所不同。一般来说，人体红细胞在低浓度抗冻剂中的最佳冷却速率约为100℃/min，哺乳类动物胚胎的最佳降温速率一般为0.2～0.8℃/min，而对于更大更复杂的细胞，则要求降温速率更慢［6-7］。

1.1.2 玻璃化低温保存方法：玻璃化是指液体转变为非晶态（玻璃态）的固化过程。玻璃化比普通的冻结固化方法引起的结构变化要小，是一种比较理想的低温保存途径。

溶液玻璃化有两个途径：① 极大地提高冷却速率；② 增加溶液浓度。如果将纯水快速投入液氮，其降温速率（103K/s）远远达不到将其实现玻璃化的降温速率（109K/s），但在纯水中加入溶质，可升高玻璃化所需冷却速率。当抗冻剂溶液 （如甘油、DMSO和丙二醇等）浓度为40%～60%时，较容易形成玻璃态，但在室温下，这样高的浓度会对细胞产生剧烈损伤。因此，玻璃化研究的重点：① 寻求容易实现玻璃化并且对细胞损害较小的溶液；② 设法提高冷却速率［1］。

1.2 低温保存常用的抗冻剂和保存液：除了极简单的微生物、病毒和细菌等外，一般生物体在没有添加抗冻剂的情况下经历低温之后很难存活下来，所以生物体的低温保存是离不开抗冻剂的。合理选择抗冻剂和配置合适的抗冻液，对低温保存至关重要［8-9］。

1.2.1 低温抗冻剂：目前的抗冻剂，按其能否渗透到细胞中可分为渗透性和非渗透型。① 渗透性抗冻剂：渗透性抗冻剂（甘油、二甲亚砜、乙二醇、乙酰胺和丙二醇等）多属于低分子中性物质，在溶液中易结合水分子，发生水合作用，使溶液的黏性增加，从而弱化了水的结晶过程，达到了保护的目的；② 非渗透型抗冻剂：非渗透型抗冻剂（聚乙烯吡咯酮、蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇、白蛋白和羟乙基淀粉等）能溶于水，但不能进入细胞，使溶液呈过冷状态，即可在特定温度下降低溶质浓度，从而起到保护作用。

1.2.2 保存液：为了保持立体细胞、组织和器官的活力，延长其寿命，提供其所需的营养和生活环境，研究人员模拟其体液和胞内液，配制了各种各样的保存液。此外，在低温冷冻前的预处理中，还常常用保存液稀释抗冻剂，形成所需的抗冻液浓度。

1.3 程序降温仪及其应用：在给样本进行降温时，要考虑很多因素，如降温速率、控温的温度范围、控温的准确度及被冷却样品的数量和形状等。因此，程序降温仪应运而生。统一的冷却速率是从室温开始每分钟降1℃直到降至-80℃，再放入液氮中进行长期存储，这适用于大多数细胞。

2 生物低温在样品存储中的应用

在生物样本库中，通常需要将样本在低温条件下存储，其原因在于样本自身生化反应在低温环境中大大降低，从而提高样本中各种成分的稳定性。但由于生物样本种类繁多（主要分为五大类：组织样本、血液样本、核酸和蛋白质样本、冻存的细胞样本、组织切片和组织芯片），因此储存方法也不尽相同。

通常经过甲醛溶液固定的石蜡包埋组织及组织切片可储存于低于27℃的环境下，但要控制虫患和湿度。

冰冻组织切片或者用于DNA和RNA提取的冰冻组织，液体样品如全血、血清、血凝块、非淋巴细胞和血浆样本应储存在-80℃。而长期储存的新鲜冰冻组织和优化的切片温度（optimum cutting temperature， OCT）包埋冰冻组织、血沉棕黄层和白细胞等长期储存的细胞系应储存在液氮中［10］。

液氮罐一般可分为储存罐和运输罐。储存罐主要用于室内液氮的静置储存，不宜在工作状态下远距离运输使用。运输罐为了满足运输的条件，专门做了防震设计，除了可静置储存外，还可在充装液氮状态下运输使用，长途运输样本的液氮罐一般选用可以航空运输的干式运输罐。

2.1 液氮液相储存（-196℃）：液态氮能使样本维持在-196℃的低温，是目前技术条件下能达到的最佳样本库保存温度。液氮容器内可装满液氮，储存更多样本，但对盛装样本的冻存管等耗材也有严格要求。与液氮气相储存相比，液态氮更易实施，但由于液态氮能渗透到冻存管内，采用液相液氮罐储存样本时，在使用前必须对冻存管进行严格的测试。

2.2 液氮气相储存（-180℃）：一般来说液氮的气相储存优于液相储存，因为气相能够将温度维持在玻璃化温度以下（-136℃），又避免了液相储存中固有的安全问题，1995年英国血库曾发生过轰动一时的液氮冻存中破裂的血袋之间乙型肝炎病毒交叉污染事件。液氮气相是更受广泛认可的方法。美国国家癌症协会、美国血库协会、样本库协会等机构的样本库操作规范文件中均推荐使用液氮气相长期储存组织样本。液氮气相是在液氮容器中加入一定量液氮，而样本储存在容器中不与液氮直接接触。液氮容器内气相区间的温度最高（容器口处）不高于-140℃（一般可达到-180℃）。较少的样本使用提桶存储，样本量大时尽量使用适配冻存盒。气相液氮罐监控要求严格，但由于其具有取放样本便捷和样本不易落入液氮罐发生交叉污染的特点，研究人员越来越多地采用了此类液氮罐。

国际上气相液氮罐厂家不多，有美国的MVE CHART和GOLD SIM，法国的AIR LIQUIDE（图1）等，均是气相液氮罐的良好选择。当然，还有一些全自动液氮罐的厂家，比如BioArchive和Askion等，但这些厂家的最高产品温度在-150℃以上，且不能对样品进行单管提取，会对样品的存储温度造成隐患，还会在提取样品时对目标样品之外的样品造成反复冻融，因此也不是样本储存的理想选择。仍需研制出全自动化单管提取的气相液氮罐，既保证样本储存温度，也确保了提取样本时不会反复冻融，保证样本的生物活性。

图1 气相液氮罐

样本库中的样品应避免反复冻融，样本反复冻融会加快生物大分子物质的降解，严重影响样本质量。

在普通的气相液氮罐存取样品时，整个冻存架会被取出暴露在常温下，目的样品之外的其他样品在高温下复温，冻存架被再次放入液氮罐中时，样品又一次冷冻。样品几次反复冻融，样品质量堪忧。因此在冻存前，最好将样本装成小份进行储存，以便单次样本取用。另外，也可使用液氮操作平台来确保操作过程中冻存架中所有样本的环境温度（图 2）。

图2 液氮操作平台

液氮操作平台是一个缩小版的气相液氮罐（图2），温度可保持在-180℃以下。当样本所在的样品冻存架从气相液氮罐中取出时，可将整个冻存架立刻放入液氮操作平台中，在操作平台内部进行样本操作。相比于常规的常温环境操作，液氮操作平台确保了所有样本的操作温度，避免了样本的反复冻融。

生物样本库的最终目的是样品的实际应用，因此，样品能否在长期储存后恢复其生物活性是样本库储存样品的最终意义。使用样本时，需要采取必要的融化和复苏。储存的温度越低，所需的时间越长。当从冷冻状态中解冻的时候，过程不宜太长，复温速度越快越好，最好的方式是37℃水浴，于1～2分钟内完成复苏。目前的复温方法包括水浴和金属浴。近年来，研究人员开始摸索利用微波加热炉作为复温工具，直接在生物材料内部进行加热，便于温度控制。但也带来许多新问题，如生物体内部的局部过热造成细胞死亡或微波对所保存的生物材料有无不利影响等。这些问题仍未解决，需要进一步研究。细胞复苏后经过一些处理即可通过二氧化碳培养箱培养进行扩增，最终用于实验。

3 生物低温在样本库的信息化管理中的应用

样品在进行程序降温后放入气相液氮罐中进行长期存储的过程中，需对样本库进行不间断地监控，包括储存室的温度、湿度、氧气浓度、二氧化碳培养箱的温度、二氧化碳浓度、超低温冰箱的温度以及液氮罐的温度和液位等，以确保样本储存的温度安全以及样本库的环境安全，我们称之为中央控制系统 （图3）。当温度和液位等参数超出设定范围时，中央控制系统会给样本库管理人员发送短信、电话和邮件等报警以提醒管理人员。

中央控制系统是样本库最重要的监控手段，保证样本库的所有仪器有条不紊，同时也大大保障了样本的安全性。另外，生物样本库还可选用全自动细胞工厂来进行细胞的储存和制备，确保细胞的批量一致性，并确保样本的安全有效无污染。如需在洁净条件下对细胞进行操作，也可选择GMP移动车间，无需在原有楼层中进行无菌管道设计，在GMP移动车间内完成所有细胞无菌操作和制备，节省样本库装修运营成本。

4 小 结

图3 中央控制系统

本文主要论述了生物低温在生物样本库主要流程中的应用以及所需设备的原理和适用范围。生物样本库为生物样本提供一个稳定安全的储存环境，生物低温帮助我们探索生物的无限可能性。当然，目前对生物低温的研究还是冰山一角，只针对于基础的细胞和一些简单的组织器官，对于复杂的系统，甚至人体的研究仍需广大同仁更深一步的研究。