器官移植生物样本库的建立及意义

毕博文，冯玉庆，梁昭，王政禄（天津市第一中心医院生物样本库，天津市器官移植临床医学研究中心，天津 300192）

器官移植是现代医学的伟大成就，其在治疗各种器官终末期疾病方面发挥着至关重要的作用［1-4］，我国器官移植总数已跃居世界前列。从提倡“循证医学”“转化医学”到迈向“整合医学”“精准医学”，现代医学正悄然发生着颠覆性的变革。丰富而优质的人体样本资源，既是生命个体生物信息的载体，又是实施整合和精准诊治的物质基础，更是未来生命科学研究的重要保障。移植医学作为跨学科交叉性前沿学科，生物样本弥足珍贵，建设规范化、标准化及资源共享的器官移植生物样本库是器官移植领域的基础性工作，将为临床诊治及科学研究提供有力支持和重要保障。

天津市第一中心医院建立了我国首家以器官移植为特色的综合性生物样本库，对器官移植相关生物样本进行了标准化采集、处理和保存，并制定了器官移植样本采集流程［5］。本研究主要探讨在现有流程下保存的生物样本能否满足对分子生物学研究的需要。

1 材料与方法

1.1 一般资料：随机选取2014年9月-2016年9月生物样本库保存的200例恶性肿瘤肝移植患者的组织及血液样本，包括乙型肝炎肝硬化合并肝细胞癌132例；丙型肝炎肝硬化合并肝细胞癌53例；酒精性肝硬化合并肝细胞癌11例；胆管细胞癌4例。

1.2 主要设备：液氮存储罐、冷藏柜、血液分装工作站、生物安全柜、切片机、组织包埋机、全自动组织脱水机、台式低温高速离心机、生物样本管理系统集、超微量紫外可见分光光度计、生物显微镜。

1.3 主要试剂：DNA、RNA提取试剂盒（日本TAKARA试剂盒）、人淋巴细胞分离液、无水乙醇、RNAlater Solution（美国Ambion试剂）、DEPC水等。

1.4 组织样本采集和保存：手术医生提前1天通知生物样本库工作人员手术安排，与患者签订知情同意书并留取术前血，手术样本离体前30分钟通知样本库工作人员进入手术室。样本库人员提前准备样本采集所需物品，负责样本采集人员穿戴防护服、无菌手套。样本离体后护士完成样本交接，核对样本数量及信息后即刻将新鲜样本转移至样本采集室。参照相关文献制定器官移植样本采集方法［6-8］，对肝脏进行脏面及膈面拍照存档，随后对肝脏进行称重并测量大小。用无菌取材刀沿肝脏长径做水平切至肿瘤最大面，采集使用无菌手术刀在位于肿瘤最远端部位采集远瘤样本，然后再在位于肿瘤边缘3 cm内采集肿瘤旁样本，随后采集肿瘤组织（肿瘤大小满足病理诊断需求，肿瘤直径≥1 cm，肿瘤诊断的组织体积大于肿瘤的50%），采集时应避免出血和坏死区域，每块体积为0.5 m3，放入冻存管内，即刻放入液氮转运罐中保存。若肝脏存在多个肿瘤组织，应依照上述流程分别采集和保存，肿瘤间距≤3cm时可共用癌旁组织。提取RNA要求样本采集器械经过DEPC水浸泡4小时以上方可使用［9］，样本采集后应立即进行RNA提取，随后置于无菌灭酶的冻存管内进入液氮保存。如不能及时提取，也可加入RNAlater置于-20℃保存［10-12］。

1.5 病理对照的采集和处理：所有保存样本均应与同采集部位取组织一块，制备石蜡切片用于质控检测并采集镜下图像保存。所有样本采集应避免肉眼所见的坏死、出血、纤维化、钙化及富含脂肪的部位。制备的石蜡块与石蜡切片放入常温蜡块、切片柜内保存。

1.6 体液样本的采集和保存：留取术前1天的晨血，术后血的采集可根据不同的器官移植并发症高发时间或临床科研需求制定采血间隔时间［13-14］。血样采集后即刻分离血清、血浆及血沉棕黄层［15-16］，置于液氮储存。若患者定期进行随访，可采集随访当日血液样本。若进行活检，则采集当日血液和尿液样本。

1.7 主要观察指标：肿瘤样本采集的准确性及坏死程度，DNA的样本生物大分子的完整性，降解程度以及电泳条带清晰程度等。

2 结 果

2.1 肿瘤组织坏死程度（图1，图2）：验证肿瘤样本采集部位的准确性，抽取已入库的200例肿瘤对照石蜡切片进行病理分析，结果显示200例样本中有192例肿瘤面积≥80%。

图1 肝细胞癌肿瘤组织（HE×4）

图2 肝细胞癌肿瘤组织（HE×10）

2.2 样本的核酸检测结果：将抽取的样本进行RNA提取，经过紫外分光光度计分析A260/A280均在1.9～2.0，对总RNA进行琼脂糖凝胶电泳，发现样本的完整性较好，受检的200例样本经琼脂糖凝胶电泳分析，RNA的28S及18S色带均较清晰，28S亮度是18S的2倍，几乎无拖尾现象，表明RNA的完整性良好（图3）。同样提取DNA，利用紫外分光光度计分析A260/A280均在1.8～1.9，利用凝胶电泳实验检测样本DNA完整性，结果显示受检DNA完整性较好，条带清晰无杂带拖尾等降解现象（图4），可以满足科研实验需求。以上实验分析结果表明，实验中样本经过规范化的采集、处理和储存可获得较好的质量。血液样本同样用此类方法进行RNA及DNA的鉴别，结果合格率分别为90%和92%，基本满足大多数科研需求，其中样本DNA及RNA样本含量较少的原因考虑为部分移植患者外周血白细胞含量较低。

图3 冻存的器官移植样本RNA电泳图

图4 冻存的器官移植样本DNA电泳图

3 讨 论

随着现代医学的发展，转化医学的地位日趋重要。倡导实验研究与临床应用双向转化的转化医学，其实质是理论与实际相结合、基础与临床相整合。这种基础研究最终转化为临床应用，需要长时间的验证，生物样本的研究就是验证的最佳手段，样本的质量决定了科研的科学性和准确性，而生物样本库作为生物样本资源采集、储存及分发应用的开放性资源共享服务平台，对于促进医疗学科建设和发展具有重要意义［17-19］。目前，生物样本库依据样本与信息分类可分为人群队列生物样本库、疾病预防控制中心（center for disease control and prevention， CDC） 生物样本库、疾病生物样本库和第三方生物样本储存中心［20］。器官移植生物样本库属于疾病生物样本库，疾病生物样本库的特点是其专业性，根据临床疾病特点，采集满足各类疾病研究相应的生物样本及其信息资源，有利于专科疾病精准医疗战略。肝移植治疗肝癌合并肝硬化的疗效优于手术切除［21-22］，然而移植术后肝癌复发制约了肝移植的发展，攻克移植后肝癌复发和转移难题势在必行。据研究表明，人体样本可以反映人体真实的生物标志物情况，对于现有病情诊断及预后研究都具有重要意义［23-24］，建立规范化生物样本库可以对样本（配对体液样本）采集、处理、储存、临床资源整合、样本转运及质量控制等环节进行系统化管理，从源头上保证样本的高质量，实现样本采集、保存及使用“无缝对接”。

组织样本进入样本库前或短时间内，对样本病理状况进行评价是保证样本质量的重要环节，利用病理技术对肿瘤占比、坏死程度及细胞结构分析对组织样本进行质量评估，若其中肿瘤成分超过80%则认为质量良好，RNA表达的研究往往要求肿瘤组织成分在70%以上，而DNA水平的研究对组织成分要求更高，如肿瘤成分不足65%则应从实验中剔除。本研究抽取已入库的200例肿瘤中有192例肿瘤面积≥80%，合格率占96%，说明样本质量较好可以满足大多数实验需求，没有达到标准的8例是由于术前抗肿瘤治疗导致的肿瘤组织坏死所致，因此，生物样本库在采集肿瘤样本前应提前。

随着分子生物学研究突飞猛进的发展，实验研究对高质量肿瘤标本的需求日益增长。降解和被污染的核酸样本会导致不一致或者不可靠的结果，因此，规范化的采集及保存样本对于样本核酸产物的质量至关重要。现有的RNA和DNA质量评价标准包括RNA浓度、纯度及片段完整性的测定，本研究利用紫外分光光度计检测200例组织样本的RNA和DNA纯度均在标准区间内，经琼脂糖凝胶电泳分析条带清晰且无杂带拖尾等现象，说明样本的RNA、DNA纯度及完整性良好。此外，特定的生物分析仪（Agilent2100/4200等）通过整合毛细管电泳和微流体芯片，可快速对RNA样本的完整性进行评价。

规范化的生物样本库除了仪器设备、试剂耗材、操作流程及质控标准之外还应该建立标准化的伦理审查制度［25］、管理制度和信息化管理才能达到现代化生物样本库的标准。优质的样本是进行相关科学研究的保障［26-27］，规范化建设器官移植生物样本库有利于临床信息资源的整合和样本质量的保障，促进器官移植领域科研的发展，具有重要的临床和科研价值。