玉米叶片硝酸还原酶活性测定方法的优化

宋月+崔婷婷+武丽娟

摘要：以玉米（Zea mays L.）自交系许178为材料，通过考察研磨方法、NADH用量、温度、pH、反应时间、显色时间对玉米叶片硝酸还原酶活性的影响获得最优试验条件。结果表明，石英砂研磨比液氮研磨测得的酶活性高；反应温度35 ℃、pH 7.5为较适反应条件；反应时间和显色时间均为10 min时测得的硝酸还原酶活性与标准方法相比无显著差异；还原剂NADH用量减少至一半测得的硝酸还原酶活性与标准方法无显著差异。综上所述，玉米叶片硝酸还原酶活性测定的优化处理方案为用石英砂研磨，加入0.15 mL NADH，在35 ℃、pH 7.5的条件下反应10 min，显色10 min。

关键词：硝酸还原酶；玉米（Zea mays L.）叶片；测定条件；优化

中图分类号：S513 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）15-2817-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.15.005

Abstract： In order to get the optimal experimental conditions，taking maize （Zea mays L.） inbred lines Xu178 as material，the effects of grinding methods，dosage of reductant NADH，reaction temperature，reaction time，pH and color developing time on nitrate reductase of maize leaves were studied. The results showed that Quartz sand grinding has higher activity than liquid nitrogen. The optimal reaction temperature was 35 ℃ and the optimal pH value was 7.5. There were no significant differences between the standard method and the reaction conditions that reaction time and coloration time were both 10 min， and also no significant differences between the half dosage of the reducing agent NADH and the standard methods dosage. In conclusion，the optimal experimental conditions to assay nitrate reductase activity of the maize leaves were that Quartz sand grinding，the reaction temperature was 35 ℃，the pH value was 7.5，the reaction time was 10 min，the color developing time was 10 min and dosage of reductant NADH was 0.15 mL.

Key words： nitrate reductase； maize （Zea mays L.） leaves； determination conditions； optimization

氮素是玉米（Zea mays L.）生长发育所需同化物质的主要来源，对玉米产量起着至关重要的作用[1]。硝酸还原酶（Nitrate reductase，NR）是植物体氮素同化和代谢过程的首个关键限速酶[2-5]，在植物高效利用氮素过程中具有重要的生物学地位，因此NR活性的高低可以反映植株的氮素营养状况和氮代谢水平[6]。研究不同玉米品种叶片NR活性的差异是反应氮效率的一个重要生理指标[7-12]。

目前报道的测定植物叶片NR活性的方法主要有活体法[13]和离体法[14]。活体法操作相对简单、快速，但是存在测定值偏低、重复性不够理想的缺点，因此在科研试验上应用较多的还是离体法。离体法操作步骤繁琐，在测定过程中需要严格控制各项操作条件，同时对于不同的植物叶片，需要的试验条件也会有所差异。本研究以玉米自交系许178穗位叶为试验材料，对研磨辅助材料、研磨时间、反应温度、反应时间、还原剂用量及pH共6个因素设置不同处理，以期筛选出玉米叶片NR活性测定的最佳方法，从而为玉米氮高效研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料取自陕西省杨凌示范区西北农林科技大学西卜村新品种示范园中进行田间试验的玉米自交系许178。于2015年7月20日，在玉米吐丝后一周时取长势均匀一致的植株穗位叶叶片，迅速放入液氮中冷冻，带回实验室放入-80 ℃冰箱保存，用于NR活性的测定。

1.2 处理因素及设计

参考《植物生理学实验指导》[15]离体法测定植物叶片NR活性的方法，针对不同的研磨方法、NADH（Nicotinamide adenine dinucleotide hydrogen）用量、温度、pH、反应时间、显色时间设置不同的处理，每个处理进行3次重复，并设空白对照。用Tecan M200型全波长酶标仪测定硝酸还原酶活性。

1.2.1 研磨方法对NR活性的影响 参考文献[15]给出的研磨方法是把植物叶片放在研钵里面，加入少量石英砂和缓冲液后手动研磨。作者在采用此方法测定NR活性的时候發现该方法研磨速度较慢，大批量测定时影响试验效率。因此，为了提高研磨速度，设置了一个液氮研磨的处理，旨在探讨不同研磨方法是否对NR活性测定有所影响。endprint

1.2.2 NADH用量对NR活性的影响 在标准方法加入0.30 mL NADH的基础上，另外设置了0.45、0.15、0.10 mL几个梯度，目的在于了解NADH用量对NR活性测定的影响。

1.2.3 pH对NR活性的影响 酶的活性不仅受到温度的影响，还受到其他因素的影响，pH就是其中的1个重要因素，本试验设置了7.0、7.5、8.0 3个pH梯度，以确定玉米NR还原反应的最适pH。

1.2.4 反应温度对NR活性的影响 反应温度是最重要的影响因素，本试验设置了20、25、30、35、40 ℃ 5个酶活反应温度梯度，目的在于确定玉米NR还原反应的最适温度。

1.2.5 反应时间对NR活性的影响 在标准方法给出的反应时间30 min基础上，另外设置了40、20、10、5 min的反应时间，目的在于确定缩短反应时间是否会影响玉米NR活性的测定。

1.2.6 显色时间对NR活性的影响 在标准方法给出的显色时间15 min基础上，另外设置了5、10、20、25 min 4个酶活显色时间梯度，目的在于确定最佳的显色时间。

1.2.7 数据分析 NR活性测定采用标准曲线法，从标准曲线中检出NO2-含量（μg/mL），以每小时每克鲜重产生NO2-的量表示酶活性，计算方法：

式中，C0和C1分别为试验初始和试验过程中根据标准曲线求的得NO2-量；Vt为反应液总体积；Vs为测定时取样体积；FW为鲜重；t为反应时间。

用Microsoft Excel 2003和SPSS 19.0 软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 研磨方法对NR活性的影响

选用了液氮研磨法和石英砂研磨法2种方法，结果如图1所示。尽管采用液氮研磨法速度较快，可以提高试验效率，但是测得的NR活性比石英砂法显著降低。因此，为了保证试验结果的可靠性和准确性，采用石英砂研磨法。

2.2 还原剂NADH量对NR活性的影响

不同的样品，其NR活性不同，对于不同的样品质量，NR的活性也是不同的[13]，因此所需NADH的量也各不相同。本试验采用了4个不同的NADH用量，试验结果如图2所示。从图2可以看出，0.45、0.15 mL NADH与0.30 mL用量的NR活性无显著差异，0.10 mL NADH与0.30 mL NADH处理间差异显著，说明将NADH用量减少到0.15 mL对试验结果无显著影响，同时增加其用量对试验也无影响，为节约成本，可将NADH的用量减少到0.15 mL。

2.3 不同pH对NR活性的影响

pH是影响酶活性的重要因素之一，只有在特定的pH条件下，酶才能够表现出最大的活性。过酸或过碱不仅会降低酶的活性，有时甚至会使酶的活性丧失。由图3可知， pH 7.5时NR的活性最大，说明其最适pH为7.5，且与pH为7.0、8.0相比，差异达到显著水平。

2.4 不同温度对玉米NR活性的影响

在一定条件下，每种酶都有其最适反应温度，低于或高于其最适反应温度都会降低酶的活性。同时，对于相同的酶，不同的植物可能其最适反应温度也有不同。《植物生理学实验指导》[15]给定的温度是25 ℃，但在预试验的基础上以及有试验证明该酶的最适温度为30 ℃[16，17]。因此，本试验设置了20、25、30、35、40 ℃的温度梯度，结果（图4）表明，温度在35 ℃时NR的活性最大，而且与其他温度差异显著，表明35 ℃为玉米NR的最适反应温度。

2.5 不同反应时间对NR活性的影响

从图5可以看出，反应时间为20、10 min时测得NR的活性与30 min时测得的酶活性无显著差异，反应时间为5、40 min时测得的NR活性与30 min测得的NR活性差异显著。因此为了快速准确地测定酶的活性，10 min是较好的反应时间。

2.6 不同显色时间对NR活性的影响

由图6可知，5 min的显色时间与其他4个时间测定的NR活性差异顯著，而其他4个时间点测定的NR活性差异不显著。因此为了节约时间，提高测定效率，可以把显色时间缩短至10 min。

3 讨论

3.1 硝酸还原酶测定中较佳的研磨方法是石英砂研磨法

本试验结果表明，石英砂研磨法比液氮研磨法对NR活性的测定更为合适，原因可能是液氮的超低温对叶片中的NR活性产生影响。在超低温下，酶的活性可能会彻底丧失，或酶在超低温下活性降低后难以恢复，从而影响酶活性的测定。与液氮研磨法相比，石英砂研磨法的温度适中，酶活性损失较少。因此对于硝酸还原酶活性的测定，石英砂研磨法是较好的选择。

3.2 适当降低NADH用量对硝酸还原酶的测定结果没有影响

NADH作为生物体中提供还原力的一种物质，对植物的生命活动影响重大，是必不可少的。在NR的测定过程中，NADH的用量对酶活性的测定也具有影响。因此，本试验针对其用量进行了探讨。本试验结果表明，NADH的用量由0.30 mL增加至0.45 mL，对结果无影响，减少其用量至0.15 mL时，对酶活性的测定影响较小，但当加入量为0.10 mL时，测得的酶活性显著降低。原因可能是在一定的提取液中，对酶的提取量是一定的。对于玉米穗位叶NR活性的测定，0.15 mL的NADH是足够的，因此增加NADH加入量对酶活性的测定没有显著差异；但当低于0.15 mL时，由于还原力不够，酶活性显著降低。因此，为节省成本，可以在不影响试验结果的同时适当减少NADH用量。

3.3 硝酸还原酶活性测定最适温度为35 ℃，最适pH为7.5

试验结果表明，玉米NR活性测定的最适还原温度是35 ℃，低于或高于这个温度都不能很好地测定NR的活性。同时发现与Averina等[18]、王学颖等[19]、刘洁等[20]、齐艳玲等[21]等的研究结果并不一致，与周树等[13]研究结果一致。这可能是因为NR作为一种酶，除了受遗传因素的决定以外，还受到多种环境因素的影响，如光、无机盐、水分和外源激素等环境因素的影响；此外，试验场地、季节、测定品种等也可能影响其结果。在试验过程中发现NR对温度特别敏感，在测定该酶活性时要特别注意温度的调控，尽量使酶处于这个温度。同时酶活力受环境pH的影响，在一定的pH下，酶表现出最大活力，高于或低于此pH，酶活力降低。pH影响酶活力的原因可能是过酸或过碱可以使酶的空间结构破坏，从而影响了酶活性部位的构象，进而影响酶的活性。因此对其进行探讨，得出该酶的最适反应pH为7.5，与齐艳玲等[21]、王学颖等[19]的结论一致，说明中性偏碱性条件有利于玉米叶片NR活性的测定。endprint

3.4 适当降低显色时间和反应时间对硝酸还原酶的测定没有影响

在酶活性测定过程中，显色时间和反应时间对酶活性的测定也具有一定的影响。显色时间过短，亚硝酸盐与磺胺及萘胺的反应不能充分进行，得出的酶活性偏低；显色时间过长，则浪费了许多时间，试验效率低。同时也发现，反应时间的长短也会对酶活性的测定产生影响，反应时间过短，反应不能充分进行，测得的酶活性低；反应时间过长，也会使测得的酶活性降低。因此在本次试验中，对反应时间和显色时间进行了优化设计。试验中共设了5个显色时间梯度进行研究探讨，结果表明，将显色时间降低到10 min对NR活性的测定结果无显著影响；但当显色时间降低到5 min时，酶活性显著降低，其原因可能是时间太短，反应还未充分进行，说明亚硝酸盐与磺胺及萘胺的反应可能在5～10 min已反应完全，之后反应液的颜色不会发生显著变化，即反应液的吸光度也没有显著变化。因此，为了节省时间，可以将显色时间缩短到10 min。同时对反应时间进行了优化，当缩短至20 min和10 min时对酶活性的测定结果没有影响，与Férrario-Mery等[22]的反应时间一致；但当将反应时间提高到40 min时，测定结果显著降低，说明30 min酶活反应已经完全结束，再延长时间已无意义，只会降低测定的结果。因此，为了提高试验效率，可以把反应时间缩短至10 min。

4 结论

分别对硝酸还原酶活性测定过程中几个重要因素设置不同处理，筛选出快速、准确、又节约成本的玉米叶片硝酸还原酶测定的最佳试验条件为用石英砂研磨，加入0.15 mL NADH，在35 ℃、pH 7.5的条件下反应10 min，显色10 min。该方法不仅能快速准确地测定玉米硝酸还原酶活性，而且可以节约时间和成本。

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