GeneXpert MTB/RIF技术对成年人结核性脑膜炎诊断价值的研究

杨元利 张永峰 刘元 周九鹏 窦权利 党丽云

·论著·

GeneXpert MTB/RIF技术对成年人结核性脑膜炎诊断价值的研究

杨元利 张永峰 刘元 周九鹏 窦权利 党丽云

目的 评价GeneXpert MTB/RIF技术检测脑脊液中的结核分枝杆菌对成年人结核性脑膜炎(TBM)的早期诊断价值。方法 选取西安市胸科医院2015年6月至2016年12月期间诊治的疑似结核性脑膜炎成年患者90例作为研究对象。研究对象均经抗结核药物治疗时间<2周，年龄≥18岁。收集患者脑脊液样本，分别用抗酸染色法、液体培养法、GeneXpert MTB/RIF技术检测。按照最新的结核性脑膜炎诊断标准，以临床评分≥6分作为参考标准，对研究对象进行分组，评价GeneXpert MTB/RIF技术的诊断价值。结果 90例研究对象中参照临床评分标准，确定为TBM组61例，非TBM组29例。GeneXpert MTB/RIF检测离心脑脊液标本阳性25例，敏感度为41.0%(25/61)，特异度为100.0%(29/29)，阳性预测值为100.0%(25/25)，阴性预测值为44.6%(29/65)。GeneXpert MTB/RIF检测未离心脑脊液标本、液体培养法、抗酸染色法检测TBM的敏感度分别为23.0%(14/61)、18.0%(11/61)、4.9%(3/61)。GeneXpert MTB/RIF检测离心脑脊液标本的敏感度高于检测未离心脑脊液标本、液体培养法及抗酸染色法，差异均有统计学意义(χ2=4.56，P=0.033；χ2=7.72，P=0.005；χ2=22.43，P<0.05)。25例经GeneXpert MTB/RIF检测离心脑脊液标本阳性患者中检出利福平耐药1例，与传统药敏结果一致。结论 GeneXpert MTB/RIF技术能快速特异地检测脑脊液中结核分枝杆菌，与抗酸染色和液体培养比较具有较高敏感度，其检测的脑脊液标本经离心浓缩处理后可提高其诊断敏感度。

结核，脑膜； 核酸扩增技术； 早期诊断； 利福平； 抗药性

结核性脑膜炎(tuberculous meningitis,TBM)是由结核分枝杆菌(MTB)感染引起的中枢神经系统感染性疾病，约占结核病发病的5%～10%,具有较高的病死率和致残率[1-2]。因此，早期快速准确的诊断对于TBM治疗及预后具有重要的意义。脑脊液的MTB涂片和培养阳性率偏低，在TBM诊断中价值不大。2011年，WHO推荐将GeneXpert MTB/RIF技术作为肺结核或疑似耐药肺结核及并发HIV感染结核病患者的首选筛查方法[3]。笔者即应用GeneXpert MTB/RIF技术检测成年TBM患者脑脊液标本，以探讨其对成年人TBM的诊断价值。

对象和方法

1.研究对象：选取西安市胸科医院2015年6月至2016年12月期间诊治的疑似TBM成年患者90例作为研究对象。研究对象均经抗结核药物治疗时间<2周，年龄≥18岁。参照2010年国际TBM协作组制定的诊断标准[4]，评分标准见表1。具备以下一项或多项脑膜炎的症状和体征：头痛、易激惹、呕吐、发热、颈项强直、抽搐、局灶性神经功能缺损、意识障碍或倦怠；根据患者的临床表现，脑脊液和头颅影像学检查结果，以及其他部位结核确诊证据进行评分，最终将患者分为4组：(1)确诊组：符合临床诊断标准，同时脑脊液检出抗酸杆菌，或脑脊液MTB或抗酸检测阳性；(2)很可能组：符合临床诊断标准，同时临床评分≥10分(无神经影像学表现)或临床评分≥12分(伴神经影像学表现)，并排除其他类型脑膜炎；(3)可能诊断组：符合临床诊断标准，同时临床评分为6～9分(无神经影像学表现)或临床评分为9～11分(伴有神经影像学表现)，而未行腰椎穿刺脑脊液检查或神经影像学检查者不得确诊；(4)非TBM组：不符合临床标准，未进行抗结核药物治疗，排除TBM。将前3组(即临床评分≥6分)作为TBM组，与非TBM组比较，进行后续试验结果的分析。本研究方案获得本院医学伦理委员会的批准。

表1 结核性脑膜炎的临床诊断评分

注 排除诊断：根据患者年龄、免疫状况、所在地理区域等情况综合判断。需排除以下诊断：化脓性脑膜炎、新型隐球菌性脑膜炎、病毒性脑膜炎、脑型疟疾、嗜酸性粒细胞性脑膜炎、脑弓形体病、脑脓肿、脑恶性肿瘤。排除这些诊断需要确凿的微生物学或病理学证据

2.仪器与试剂：(1)仪器：BACTEC MGIT 960液体培养系统(美国BD公司，批号：4087168)；Gene Xpert MTB/RIF扩增检测仪(美国Cepheid公司，批号：4140541)。(2)试剂：抗酸染色试剂(珠海贝索生物有限公司)；MGIT液体培养管(美国BD公司)、分枝杆菌联合药物敏感性检测试剂盒(美国BD公司)；分枝杆菌培养添加试剂盒(美国BD公司)；GeneXpert MTB/RIF检测试剂盒(美国Cepheid公司)。

3.抗酸染色法：抗酸染色涂片检查参照《中国结核病防治规划痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》[5]中的标准化操作程序执行。具体方法为标本涂片，干燥后行抗酸染色、镜检。

4. BACTEC MGIT 960培养和药物敏感性试验(简称“药敏试验”)：采用BACTEC MGIT 960液体培养，参照《结核分枝杆菌药物敏感性实验标准化操作程序及质量保证手册》[6]中的标准化操作程序执行。取处理好的脑脊液标本1 ml加入MGIT液体培养管中，放入BACTEC MGIT 960液体培养系统中进行培养；培养阳性的标本进一步行药敏试验。BACTEC MGIT 960系统药敏试验是将从结核病患者分离得到的MTB在已知浓度的检测药物存在的条件下进行体外培养，观察其生长状况，同时与不加任何药物的对照管进行比较，若菌株在对照及药物培养管中均生长，则认为该菌株对该药物耐药；若只在对照管中生长，则认为该菌株对该药物敏感。

5.脑脊液GeneXpert MTB/RIF检测：(1)收集每例患者脑脊液6 ml，1 ml直接与2倍体积的处理液混匀，涡旋振荡1 min，取2 ml混合液放入仪器中进行核酸扩增。2 h内仪器会自动输出检测结果，即菌量及是否对利福平耐药。当6条探针中除了质控探针外至少2条探针发出荧光时可判定为MTB感染。(2)另5 ml脑脊液经3000×g离心15 min，去上清，留1 ml与2倍体积的处理液混匀，涡旋振荡1 min，取2 ml混合液放入仪器中进行核酸扩增，2 h内仪器会自动输出检测结果，即菌量及是否对利福平耐药。当6条探针中除了质控探针外至少2条探针发出荧光时可判定为MTB感染。

6.统计学分析：应用SPSS 17.0软件对数据进行分析，计数资料的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.基本情况：90例研究对象中，经液体培养阳性，确诊为TBM者11例(12.2%，11/90)。50例虽然无明确病原学依据，但符合很可能组(36例)和可能诊断组(14例)的临床评分要求。另外29例(32.2%，29/90)为非TBM者，包括病毒性脑膜炎17例、化脓性脑膜炎5例、新型隐球菌性脑膜炎4例、脑肺包虫病1例、系统性红斑狼疮脑病1例、脑布氏杆菌病1例。

2.检测效能比较：GeneXpert MTB/RIF检测离心脑脊液标本阳性25例，敏感度为41.0%(25/61)，特异度为100.0%(29/29)，阳性预测值为100.00%(25/25)，阴性预测值为44.6%(29/65)。GeneXpert MTB/RIF检测未离心脑脊液标本、液体培养法、抗酸染色法检测TBM的敏感度分别为23.0%(14/61)、18.0%(11/61)、4.9%(3/61)。GeneXpert MTB/RIF检测离心脑脊液标本的敏感度高于检测未离心脑脊液标本、液体培养法及抗酸染色法，差异均有统计学意义(χ2=4.56，P=0.033；χ2=7.72，P=0.005；χ2=22.43，P<0.05)，见表2。

3.利福平耐药检测：25例经GeneXpert MTB/RIF检测离心脑脊液标本阳性患者中检出利福平耐药1例。该例是经培养确诊的TBM，使用MGIT SIRE试剂盒进行检测，得出此株MTB的药敏结果为异烟肼、利福平均耐药；其余24例患者经GeneXpert MTB/RIF检测结果均为利福平敏感，其中10例液体培养阳性，菌株经检测也均为利福平敏感。

讨 论

TBM是结核病最严重的形式，预后依赖于早期快速诊断，所以寻找早期快速准确的诊断方法一直是临床上亟待解决的问题。最新的TBM诊断专家共识指出，脑脊液培养、抗酸染色或PCR中任意一项阳性者可确诊为TBM[4]；但脑脊液抗酸染色、MTB培养阳性率低，且培养花费时间久，约4～6周，对TBM早期诊断价值有限[7]。

GeneXpert MTB/RIF技术以荧光定量PCR技术为基础，集样品收集、核酸提取、样品扩增于一体，其对目标DNA序列的检测具有高度光学敏感度，实时光学监测一经发现目标序列即可给出报告，极大缩短了化验检测时间，从上样到结束的全过程约2 h，且操作方便。目前，GeneXpert MTB/RIF法因其较高的敏感度和特异度已逐渐开展并广泛应用于肺结核及肺外结核的诊断[8-10]。WHO推荐GeneXpert MTB/RIF检测为TBM初次检测优先方案，该方法在TBM的早期诊断中有巨大优势[11-12]。Nhu等[11]研究显示以临床诊断为金标准，GeneXpert MTB/RIF检测的敏感度为59.3%，特异度为99.5%，通过在样本前处理中加入涡旋混匀步骤，其敏感度提高了20.6%，检测并发HIV感染的TBM患者敏感度高达78.8%。

表2 不同方法检测结核性脑膜炎患者脑脊液标本的检测效能

注 敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%；阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%

本次研究共纳入90例疑似TBM成年患者的脑脊液标本，由于TBM患者的脑脊液微生物学检测阳性率低，确诊患者较少，故此次研究将临床诊断作为金标准。结果显示，GeneXpert MTB/RIF检测离心脑脊液标本的敏感度高于传统抗酸染色法、液体培养法，以及未离心标本的检测，差异均具有统计学意义，这一结果在TBM临床诊断中具有非常重要的意义。其与国外研究比较，本次研究敏感度不高的原因考虑可能为纳入患者数量少；另一方面，国外研究中TBM并发艾滋病患者所占比例多，这类患者免疫力较差，脑脊液中MTB含量可能较多，这可能会增加GeneXpert MTB/RIF的检出效率[11-12]。从检测特异度方面来看，GeneXpert MTB/RIF具有非常好的确定诊断的价值，本研究中为100.0%，并通过临床症状、影像学、脑脊液化验及治疗随访证实符合TBM。

GeneXpert MTB/RIF技术可以同时检测利福平耐药，该技术以MTB的rpoB基因为靶基因，自动提取DNA后扩增rpoB基因进行检测。本次研究中应用GeneXpert MTB/RIF检测出1例利福平耐药，并通过传统药敏试验得以确认。由于本次研究耐药TBM例数少，尚不能评价其耐利福平的检测效能。

综上所述，GeneXpert MTB/RIF技术有其显著的优点：第一，能快速特异地检测脑脊液中MTB，全部检测过程2 h，与抗酸染色和液体培养法比较具有较高敏感度，并且该技术对于优化即离心浓缩处理后的脑脊液标本具有更高的检测敏感度；第二，可用于检测MTB的利福平耐药性，为临床提供可靠的依据；第三，检测系统操作简单，将复杂步骤集中完成，避免人工提取过程中可能污染造成的假阳性结果；第四，本研究对照组中无一例检测为阳性，特异度为100.0%。结合以上优点，GeneXpert MTB/RIF技术可以作为成年人TBM早期诊断的分子检测手段。

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(本文编辑：李敬文)

Diagnostic value of GeneXpert MTB/RIF for tuberculous meningitis in adults

YANGYuan-li,ZHANGYong-feng,LIUYuan,ZHOUJiu-peng,DOUQuan-li,DANGLi-yun.

Xi’anChestHospital,Xi’an710100,China

Correspondingauthor:DANGLi-yun,Email:dangliyun@sina.com

Objective To evaluate the diagnostic value of GeneXpert MTB/RIF for the early diagnosis of tuberculous meningitis in Adults. Methods Ninety predominantly adults with suspected meningitis were screened prospectively from Xi’an chest hospital between June 2015 and December 2016. All subjects aged ≥18 years were treated with anti-tuberculosis drug for <2 weeks. Samples of cerebrospinal fluid were collected and tested by Ziehl-Neelsen staining, MGIT960 liquid culture and GeneXpert MTB/RIF. And the enrolled patients were grouped according to 2010 South African expert consensus. The diagnostic performance of GeneXpert MTB/RIF was evaluated by camparing against clinical scored ≥6 points. Results Of the 90 patients,61 were in TBM group, and 29 were in no-TBM group. Twenty-five positive cases of cerebrospinal fluid (CSF) were tested by GeneXpert MTB/RIF,the sensitivity was 41.0% (25/61),the specificity was 100.0% (29/29),the positive predictive value was 100.0% (25/25),and the negative predictive was 44.6% (29/65).The sensitivity of GeneXpert MTB/RIF (non-centrifugal CSF), MGIT 960 liquid culture and Ziehl-Neelsen staining were 23.0% (14/61), 18.0% (11/61) and 4.9% (3/61), respectively. Compared with the sensitivity of GeneXpert MTB/RIF (centrifugal CSF),the significant differencse were found among the sensitivity of GeneXpert MTB/RIF (non-centrifugal CSF),MGIT 960 liquid culture and Ziehl-Neelsen staining (χ2=4.56,P=0.033;χ2=7.72,P=0.005;χ2=22.43,P<0.05). Rifampin resistance was found in 1 case, consistent with traditional drug susceptibility test. Conclusion GeneXpert MTB/RIF is a rapid and specific method to detect MTB in CSF. Compared with Z-N stain and MGIT 960, it has higher sensitivity. After centrifugal CSF, it could improve the sensitivity of diagnosis of TBM.

Tuberculous, meningeal; Nucleic acid amplification techniques; Early diagnosis; Rifampin; Drug resistance

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.09.016

西安市卫生和计划生育委员会科研项目(J201602017)

710100 西安市胸科医院

党丽云，Email：dangliyun@sina.com

2017-03-15)