酪蛋白酸钠和阿拉伯胶相互作用的研究及纳米粒的制备

刘春花,周爱梅,*,杨 苒,彭丹盈,刘 欣,曹 庸

(1.华南农业大学食品学院,广东广州 510642; 2.广东省天然活性物工程技术研究中心,广东广州 510642)

酪蛋白酸钠和阿拉伯胶相互作用的研究及纳米粒的制备

刘春花1,2,周爱梅1,2,*,杨 苒1,彭丹盈1,刘 欣1,2,曹 庸1,2

(1.华南农业大学食品学院,广东广州 510642; 2.广东省天然活性物工程技术研究中心,广东广州 510642)

酪蛋白酸钠,阿拉伯胶,相互作用,纳米粒,稳定性,机制

功能性食品中具有生理功效的活性物质,如维生素、益生菌、活性多肽等,在进入人体后能够促进健康,但其在体内的生物利用度低[1]。纳米技术(nanotechnology)的出现成为解决生物活性物低口服生物利用度问题的一种有效途径[2]。纳米粒制备是纳米技术应用于生产的重要途径之一。纳米粒(nanoparticles)是直径为10～1000 nm的一类聚合物胶体系统,由于其微小体积和特殊结构,在胃肠道能成批地被转运,因此除具备传统活性物输送体系所具有的诸如提高活性物的溶解度、增加活性物的稳定性以及缓释等优点外,还可以大幅度地改变活性成分的组织分布和代谢,提高功能效果并降低毒副作用[3]。

构建纳米粒的载体材料要求具有良好的生物相容性和生物可降解性,并且是一般认为安全(Generally recognized as safe,GRAS)级别。以往报道的一些纳米粒的构建涉及使用具有潜在毒性的溶剂或不可降解的材料,增加了口服利用的难度[4],因此需要一些更为安全的食品级大分子来应对这一挑战。蛋白质和多糖是食品体系中的两类重要的大分子,它们通过相互作用形成的纳米粒除能满足上述要求外,还对包埋的活性物具有更为突出的承载效果和靶向传递效果,最终实现活性物的缓释和控释[5]。因此利用蛋白质与多糖之间的相互作用构建纳米粒并作为活性物质的输送载体是近年来纳米领域的研究热点[6]。

酪蛋白酸钠(SC)具有良好的表面活性、稳定性、成胶性、亲水性和自组装特性[7],是良好的制备纳米载体的材料[8]。同时,阿拉伯胶(GA)具有良好的水溶性和稳定性且无毒、生物相容性好、可生物降解,也是理想的载体材料[9]。但目前关于SC和GA相互作用及利用两者相互作用制备纳米粒的研究很少,且现有研究不深入、不系统,仍有很多关键技术和科学问题需要解决[10-11]。因此本文以SC与GA复合体系作为研究对象,通过调控体系 pH、SC/GA浓度比、SC与GA总浓度和NaCl浓度,研究不同因素对SC和GA相互作用及纳米粒形成的影响,探讨SC和GA相互作用形成纳米粒的机制,为利用SC与GA复合物制备纳米递送载体提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酪蛋白酸钠(纯度98%)和阿拉伯胶(纯度97%) 均购自美国Sigma公司,其他试剂均为分析纯 来自国药集团化学试剂有限公司。

AL104万分之一电子天平、FE20 pH计 梅特勒-托利多仪器有限公司;JK-MSH-Pro-6B多头独立控温磁力加热搅拌器 上海精学科学仪器有限公司;PC950连续浊度比色计 美国安东帕(STH)公司;90 plus纳米粒度及Zeta电位仪 美国布鲁克海文仪器有限公司;JEM-2100F场发射电子显微镜 日本电子株式会社;VERTEX 70傅里叶变换红外光谱仪 德国BRUKER公司;RF-5301PC荧光分光光度计 岛津制作所。

1.2 实验方法

1.2.1 SC和GA贮藏液的制备 将一定质量的SC和GA溶于去离子水中,配制成浓度分别为10 mg/mL和10、100 mg/mL的SC和GA溶液,于600 r/min、室温下搅拌3 h,然后置于4 ℃静置过夜,得到SC和GA贮藏液。制备SC-GA复合物时将贮藏液按照对应的配比加入到相应浓度的NaCl体系中。实验中用到的所有试剂、溶液均用0.45μm滤膜过滤后使用。

1.2.2 不同因素对SC与GA相互作用及纳米粒形成的影响 参照Ye等[10]的方法并稍作改进:在转速为400 r/min、25 ℃下搅拌条件下,加入一定浓度的NaCl(0、5、10、20、30、40、50、60、80、100 mmol/L,固定SC/GA浓度比为1∶2,SC与GA总浓度为3 mg/mL),调节pH至6.5附近,按照一定SC/GA浓度比(9∶1、5∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶5、1∶9,固定SC与GA总浓度为3 mg/mL,NaCl浓度为10 mmol/L)加入SC贮藏液,将GA贮藏液按照对应的比例逐滴加至搅拌的SC溶液中,控制体系中SC和GA的总浓度(4、3、2、1.5、1.2、0.9、0.6、0.3 mg/mL,固定SC/GA浓度比为1∶2,NaCl浓度为10 mmol/L)为一定值,将体系pH从6.5调节到2.0左右,在调节到一定pH时取样,静置24 h,测定复合物的浊度,以pH为横坐标、浊度为纵坐标绘制相变图,同时表征复合物的粒径和Zeta电位,以研究pH、SC/GA浓度比、SC与GA总浓度和NaCl浓度等因素对SC与GA相互作用及纳米粒形成的影响。

1.2.3 浊度的测定 按上述方法制备SC-GA复合物,在25 ℃下用PC 950连续浊度比色计在420 nm波长下对样品的透光率进行测定,再根据下式计算浊度(Turbidity,T)。每次测量前均用去离子水将透光率校准到100%。

Turbidity(%)=100%-透光率

1.2.4 动态光散射粒径分析 取上述方法制备的SC-GA复合物溶液适量于样品池中通过动态光散射法(DLS)测定纳米粒复合物在水中的流体力学直径Dh(Particle size)和多分散指数(Polydispersity index,PDI)。

1.2.5 Zeta电位分析 利用Zeta电位仪通过耙电极测定样品通电后的电泳迁移率,计算纳米粒复合物的Zeta电位。

1.2.6 微观形貌分析 采用透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)观察SC-GA纳米粒的表面形态及大小。将待测样品滴在干净的铜网表面,保持2 min,用滤纸擦净多余的样品溶液,然后用2%(w/v)的磷钨酸溶液染色3 min,吸去多余的染液,在空气中经数分钟风干后进行电镜观察,测试加速电压为80 kV。

1.2.7 纳米粒贮藏稳定性研究 在SC/GA浓度比为1∶1,pH4.2,SC与GA总浓度3 mg/mL,10 mmol/L NaCl条件下制备纳米粒,于4 ℃下分别贮藏7、15、30 d后进行粒径和Zeta电位的表征。

1.2.8 傅里叶红外光谱(FTIR)分析 取少许SC、GA、两者的混合物(按照质量比1∶1研磨,混合均匀)和冻干的SC-GA纳米粒样品,分别按1∶100的比例与溴化钾混合研磨,经压片机压成透明的薄片,在4000～400 cm-1的范围以4 cm-1的分辨率扫描32次,采集样品图谱,环境温度为25 ℃。在与测试样品相同的条件下采集背景。

1.2.9 荧光光谱分析 固定SC浓度为0.5 mg/mL,按照SC/GA(浓度比)为0∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶16、1∶20的比例制备SC-GA纳米粒复合物,分别在25、35 ℃水浴中保温3 h后进行测定。测定过程中固定激发波长λex=280 nm,激发狭缝和发射狭缝分别为5、3 nm。荧光扫描速度为1200 nm/min,扫描范围分别为300～500 nm。

1.2.10 数据统计分析 实验数据采用Origin 9.0软件作图,SPSS Statistics 17.0.1 软件进行方差分析,所有实验均重复3次。

2 结果与分析

2.1 SC与GA溶液的浊度、Zeta电位随pH的变化

浊度可以有效的表征两种物质复合凝聚的过程,它在一定程度上可以反映分散质的大小,浊度越大,说明体系中大分子颗粒物的数量越多[12]。SC与GA溶液浊度随pH变化的结果如图1所示,随着pH的降低,GA溶液的浊度没有显著性变化(p>0.05),说明GA溶液受pH影响小,稳定性好。SC却不同,开始阶段,随着pH的降低,浊度没有显著性变化(p>0.05),当 pH<6.0时,浊度开始显著地增大(p<0.01),这是因为此时SC中的4种酪蛋白按照一定的顺序(先κ,β，然后αs1，最后αs2)发生溶解,同时SC结构中的胶体磷酸钙从其胶粒中溶解出来,SC的胶束结构倾向于聚集,所以浊度会显著增大[13];直到pH达到5.1时,浊度达到最大,之后继续降低pH,浊度显著地降低(p<0.01),这是因为SC结构中的胶体磷酸钙完全溶解,胶体所带电荷下降导致胶粒间的静电排斥作用减弱,发生自聚集形成大颗粒的絮状沉淀物,此时发生相分离[14];当pH达到4.6时,浊度最小,这是因为体系此时达到SC的等电点,SC的溶解度最低,沉淀量达到最大,沉降到底部;继续降低pH,浊度开始增大(p<0.01),这是因为SC链上所带的正电荷越来越多,静电斥力逐渐增大致使聚集的沉淀物开始发生部分解离[15];当pH达到3.5时,浊度达到第二个极值点,说明此时沉淀发生完全解离;之后降低pH,浊度逐渐降低,这是因为随着pH的进一步降低,SC分子链上带有更多的正电荷,SC的溶解度增加从而导致体系浊度降低[16]。

图1 SC与GA浊度随pH的变化 Fig.1 Change of turbidity of pH of SC and GA under different pH注:SC、GA浓度均为1 mg/mL,NaCl 浓度:0 mmol/L。

对SC和GA在不同pH下的Zeta电位进行表征,结果如图2所示。图2显示SC等电点约为4.6,GA的pKa约为2.4,这与文献报道的一致[17-18]。

图2 SC和GA Zeta电位随pH的变化Fig.2 Change of Zeta potential of SC and GA under differnt pH

2.2 pH对SC和GA相互作用及纳米粒形成的影响

pH对SC和GA相互作用的影响见图3,从图3可以看出pH大于5.6时(图中的区间Ⅰ),浊度比较低且无显著性变化(p>0.05),溶液基本上呈无色,说明此时体系中SC与GA均带负电荷,两者在溶液中呈现共溶状态分散于溶液中;pH小于5.6(此pH称为pHc,为两者开始发生结合生成可溶性复合物的pH[19])时,随着pH的继续减小,浊度突然开始快速增长(p<0.01),表明SC开始与GA发生复合,此阶段虽然没有到达SC的等电点,但其带正电的支链片段已经开始与GA带负电的片段结合[20];pH降至5.2后,继续降低pH,浊度缓慢增大(p>0.05),当pH为3.6(此pH称为pHφ1,为可溶性复合物生成量达到最大的pH[21])时,浊度达到第一个极值点,此阶段浊度变化小;当pH小于3.6时,浊度又开始迅速增大(p<0.01),当pH达到3.3(此pH称为pHopt,表示SC、GA两者复合物达到静电平衡、体系发生相变的pH[22])时,浊度达到最大值,此时有沉淀颗粒出现,这是二者解离出的相反电荷数值相等达到静电平衡的结果,说明此时体系发生了相变,可溶性纳米复合物聚集形成不溶性沉淀[23],因此pHc-pHopt阶段(图中的区间Ⅱ)二者形成了可溶性的稳定纳米粒复合物;继续降低pH,浊度急剧降低(p<0.01),这是沉淀沉降分层所导致,之后浊度开始增大(p<0.01),表明不溶性沉淀复合物沉淀开始部分解离,到pH2.3时(此pH称为pHφ2,为不溶性复合物沉淀完全解离的对四个关键pH点进行粒径和Zeta电位的表征,结果见表1。分析表1,可以得到浊度随pH的减小先升后降(p<0.05),在pH3.3时达到峰值;粒径和多分散指数(PDI)也呈先升后降的趋势,其中pH5.6和pH3.6粒径较小(均小于150 nm),二者之间没有显著性差异(p>0.05),PDI在pH5.6和pH3.6时具有显著性差异(p<0.05),而Zeta电位的绝对值却是先降后升,其中pH5.6和pH3.6时体系Zeta电位较大(均大于15 mV),且二者之间没有显著性差异(p>0.05)。pH5.6到pH3.6阶段粒径的增加是因为当pH小于4.8后,SC及GA在体系中带有相反的电荷,随着pH的减小,SC所解离出的正电荷电量逐渐增加,有更多的SC能与之通过静电吸引发生自组装而从溶液状态向乳液转变,即有一定尺度的粒子形成,表现为粒径增加[27]。当pH降低到3.3时,粒径达到最大,此时体系发生相变,形成不溶性沉淀物,Zeta电位的绝对值达到最小,这是体系正负电荷达到静电平衡的结果,而此时粒径达到最大值则主要是因为粒子表面的带电量不足以产生足够大排斥力,导致粒子之间发生聚集产生大颗粒沉淀。同时此时PDI值超过0.5,说明体系中有多种尺寸的聚集物,溶液中的复合物不均一。比较四个关键pH点,最佳制备纳米粒的pH点为pHφ1。

图3 SC和GA复合物浊度随pH的变化Fig.3 Turbidity of SC-GA complexes under different pH

表1 体系不同pH下的SC-GA复合物的表征Table 1 Characterization of SC-GA complexes at different pH values

注：不同的字母表示不同组之间具有显著性差异(p<0.05),表2～表5同。pH[24])浊度达到第三个极值点,说明此时沉淀完全解离消失,所以pHopt-pHφ2阶段(图中的区间Ⅲ)二者形成了不溶性沉淀;随着pH的继续降低(小于pHφ2,图中的区间Ⅳ),浊度迅速减小(p<0.01),这是因为此时GA(pKa约为2.4)与SC都带正电,二者产生的静电斥力使其再次处于溶胀状态。以上变化说明SC与GA之间的相互作用以及是否可形成纳米粒极大的受到pH的影响,证明SC与GA的复合作用主要是静电相互作用[25],这与其他蛋白和多糖通过静电相互作用结合形成纳米粒复合物的现象一致[16,18,23,26]。

在pHc至pHopt之间取样对复合物进行粒径、Zeta电位表征,结果如图4所示。从图4可以看出,随着pH的减小,粒径先增大后减小然后再增大,且pH5.2时粒径最小,而pHφ1(3.6)复合物粒径与最小值具有显著性差异(p<0.05);PDI随着pH的减小先减小后增大,在pH3.6时达到最小;复合物Zeta电位的绝对值随pH的减小先缓慢减小,到pH小于3.6时急剧减小,表明复合物逐渐趋于不稳定的状态,而pH3.6时复合物Zeta电位的绝对值为18.61 mV,大于15 mV,且与最大值(pH5.2)不具有显著性差异(p>0.05);浊度随pH的降低逐渐增大,而复合物浊度的大小可以反映体系中颗粒物的多少,在保证体系中大分子不发生聚集的前提下可以适当降低pH以提高体系浊度[27],图4反应pH3.4时浊度达到最大,但此时粒径达到最大且超过300 nm,PDI达到最大值0.2,Zeta电位绝对值达到最小(小于15 mV),此时体系更趋向于不稳定的状态。综上,pH3.6时粒径小于200 nm,Zeta电位绝对值大于15 mV,PDI最小,体系分布均匀,浊度接近90%,纳米颗粒多,体系稳定,因此pHφ1是比较适宜制备稳定纳米粒的pH点,这与Ye[10]等的研究结果一致。

图4 pH对SC和GA复合物粒径、PDI(a),浊度、Zeta电位(b)的影响Fig.4 Effects of pH on particle size,PDI,turbidity and zeta potential of SC and GA complexes

2.3 SC/GA浓度比对SC和GA相互作用及纳米粒形成的影响

从图5和图6可知,当SC、GA两者浓度比小于1时,随着SC浓度的增加,pHc变化不大(p>0.05),pHφ1显著增大(p<0.05),pHopt增大(p<0.05),pHφ2基本保持不变(p>0.05);两者比例大于1时,随着SC浓度的增加,pHc变化不大(p>0.05),pHφ1增大(p<0.05),pHopt增大(p<0.05),pHφ2增大(p<0.05)。但比例大于1时,每个GA多糖链通过静电相互作用结合SC的能力达到饱和,剩余的SC在酸化过程中大量聚集产生沉淀,体系稳定性下降,所以形成稳定复合物的比例应小于2,林柳风[5]在研究溶菌酶与果胶相互作用的时候也得到类似的结论。

图5 不同浓度比的复合物体系浊度随pH的变化Fig.5 Change of turbidity with pH under different concentration ratio of SC to GA注:(a)浓度比(SC/GA)≤1(b)浓度比(SC/GA)≥1。

图6 复合物体系关键pH点随SC和GA浓度比的变化Fig.6 Change of critical pH under different concentration ratios of SC to GA

制备复合物过程中观察体系状态的变化结合相变图得到各个比例下的pHφ1,在该pH下制备纳米粒复合物,对复合物的粒径、Zeta电位表征结果见表2。由表2可知,随着SC浓度的增加,纳米粒在pHφ1处的粒径、PDI均呈先减小后增大之后又减小的趋势,Zeta电位的绝对值先增大后减小之后又增大,浊度逐渐增大;浓度比大于2时,pHφ1超过5,高于SC的等电点,SC和GA的结合程度不高,此外体系在高pH区域即产生沉淀,体系趋于不稳定的状态;比例1∶1和1∶2在pHφ1处形成的纳米粒粒径均小于150 nm,二者没有显著性差异(p>0.05),PDI均小于0.2,且1∶1时小于0.1,二者具有显著性差异(p<0.05),Zeta电位的绝对值均大于15 mV且具有显著性差异(p<0.05),浊度在1∶1时大于1∶2且具有显著性差异(p<0.05),复合物浊度的大小可以反映体系中颗粒物的多少,在保证体系中大分子不发生聚集的前提下浊度越大说明体系中纳米颗粒的数量越多。综上,体系1∶2～1∶1范围在pHφ1形成的粒子粒度分布均一、带电量大,综合考虑PDI、Zeta电位和浊度,其中1∶1时形成的粒子粒度分布更均匀,带电量更大,更稳定。

表2 不同浓度比的SC和GA在pHφ1形成的纳米粒的的表征Table 2 Characterization of nanoparticles formed at pHφ1 with different concentration ratios of SC and GA

2.4 SC与GA总浓度对SC和GA相互作用及纳米粒形成的影响

结合图7、图8可知,体系聚合物总浓度≤3 mg/mL时,pHc、pHφ1、pHopt和pHφ2基本不变(p>0.05),且随着体系聚合物总浓度的增大,各拐点对应的 T增大(p<0.05);体系聚合物浓度达到4 mg/mL时,pHφ1急剧增大(p<0.01),pHc、pHopt和pHφ2基本不变(p>0.05)。过了pHc点,随着pH的降低,浊度迅速增大(p<0.05),这是因为此时体系发生相分离,稳定性下降。有研究表明蛋白质和多糖混合体系中相分离的发生出现在二者浓度高于某一临界浓度的情况下[28],所以SC和GA复合体系的临界浓度为4.0 mg/mL,因此形成稳定纳米复合物的体系聚合物浓度应小于临界浓度4.0 mg/mL。

表3 不同SC与GA总浓度体系在pHφ1下形成的纳米粒的表征Table 3 Characterization of nanoparticles formed at pHφ1 with different biopolymer concentrations of SC and GA

图7 不同SC与GA总浓度复合物体系浊度随pH的变化Fig.7 Change of turbidity with pH under different biopolymer concentration

图8 关键pH点随SC与GA总浓度的变化 Fig.8 Change of critical pH under different biopolymer concentrations of SC and GA

制备复合物过程中观察体系状态的变化结合相变图得到各个浓度下的pHφ1,在该pH下制备纳米粒复合物,对复合物的粒径、Zeta电位表征结果见表3。由表3可知,随着SC与GA总浓度的降低,复合物在pHφ1形成的纳米粒粒径逐渐减小,在3.0 mg/mL浓度以下时粒度小于200 nm,PDI先减小后增大,且在3.0 mg/mL时达到最小,Zeta电位绝对值先增大后减小,且在2.0 mg/mL时达到最大,但3.0 mg/mL时Zeta电位的绝对值与2.0 mg/mL时均超过18 mV且二者没有显著性差异(p>0.05),浊度逐渐减小。综合以上各指标,得到形成纳米粒的SC与GA总浓度范围为1.2～3.0 mg/mL,考虑到形成纳米粒的数量,最佳浓度为3.0 mg/mL。

2.5 NaCl浓度对SC和GA相互作用及纳米粒形成的影响

总之，在水利工程建设阶段，结合施工合同的各项条款，加强对各种风险的分析，制定切实可行的控制措施，保证施工进度，才有利于确保工程建设的顺利开展及社会、经济效益的提升。

结合图9、图10可知,与不加NaCl相比,低浓度的盐(5,10 mmol/L)的加入使得未达到pHφ1之前各点的T减小(p<0.05);NaCl浓度大于10 mmol/L时,pHφ1和pHφ2对应的T增大(p<0.05);NaCl浓度达到50 mmol/L时,相变图形状发生改变,与单独SC存在时的相变图类似,这是因为高盐产生静电屏蔽作用,对大分子的自组装聚合行为有抑制作用[29];随着NaCl浓度的增加,pHc减小(p<0.05),体系形成可溶性复合物的起点发生左移。这是由于 NaCl 溶解后会在体系中释放出 Na+和 Cl-离子,两种带电离子在电荷相互作用下结合到SC、GA分子上带相反电荷的区域上,引起对大分子静电作用的竞争效应,减少了蛋白质和多糖体系中可以发生作用的电荷的数目,从而降低SC-GA复合物形成能力[30],所以表现为pHc向更小的pH移动。pHφ1在NaCl浓度≤10 mmol/L时缓慢增大(p>0.05),当NaCl浓度由10 mmol/L增大到20 mmol/L时,pHφ1急剧增大(p<0.01),此后又缓慢增大(p>0.05),pHopt在NaCl浓度≤20 mmol/L时缓慢增大(p>0.05),当NaCl浓度由20 mmol/L增大到30 mmol/L时,pHopt迅速增大(p<0.01),此后又缓慢增大(p>0.05);pHφ2在这个过程中略有增大(p>0.05)。以上实验结果证实由于氯化钠的存在,增加了体系离子强度,对复合物的形成起静电屏蔽作用,进一步说明SC与GA复合作用主要是静电相互作用[31]。

图9 不同NaCl浓度的复合物体系浊度随pH的变化Fig.9 Change of turbidity with pH under different NaCl concentration注:(a)NaCl浓度<50 mmol/L(b)NaCl浓度≥50 mmol/L。

图10 关键点pH随NaCl浓度的变化Fig.10 Change of critical pH under different NaCl concentrations

制备复合物过程中观察体系状态的变化结合相变图得到不同NaCl浓度下的pHφ1,在该pH下制备纳米粒复合物,对复合物的表征结果见表4。从表4可以看出,随着NaCl浓度的增加,纳米粒复合物的粒径呈先减小、后增大的趋势,且在NaCl浓度为10 mmol/L粒径最小且分布最均匀,Zeta电位的绝对值先增大后减小,且在NaCl浓度为10 mmol/L时达到最大(超过15 mV),浊度逐渐增大,但在0～10 mmol/L范围内没有显著性差异(p>0.05)。说明与不加NaCl相比,低浓度的盐(5,10 mmol/L)的加入使体系趋于更稳定的状态。这是因为含离子的聚合物(SC)成盐后,离子强度增加使得复合物形成更加紧密堆积的聚集态,颗粒粒径减小,所以此时粒径下降[32],而高浓度的盐(大于40 mmol/L)的加入使体系使两者的静电相互作用逐渐被抑制,体系粒径逐渐增大,Zeta绝对值减小,体系稳定性下降。此外体系NaCl浓度在大于20 mmol/L时Zeta电位绝对值小于15 mV,所以形成稳定纳米粒的盐浓度不宜太高(小于20 mmol/L)。综合比较各个指标,体系在NaCl浓度为10 mmol/L时,粒径与PDI达到最小,Zeta电位绝对值达到最大,且与其他组具有显著性差异,同时浊度较大,生成的纳米粒数量多,所以确定的最佳盐浓度为10 mmol/L。

表4 不同NaCl浓度体系在pHφ1下形成的纳米粒的表征Table 4 Characterization of nanoparticles formed at pHφ1 with different NaCl concentrations

2.6 微观形貌分析

在SC∶GA=1∶1(浓度比),总浓度3 mg/mL,10 mmol/L NaCl,pH4.2条件下制备SC-GA纳米粒,并通过透射电镜观测SC-GA纳米粒在干态的形貌,如图11所示。由图11可以看出,干态纳米粒子呈球形,分散均匀,透射电镜表征得到的纳米粒粒径分布在150 nm左右,与用激光粒度仪测得平均粒径(约142 nm)接近。

图11 SC-GA纳米粒的透射电镜图Fig.11 Transmission electron micrographs of SC-GA nanoparticles

2.7 纳米粒贮藏稳定性

纳米粒贮藏稳定性结果如表5所示,在贮藏7 d时粒径和Zeta电位与原样相比无显著性差异(p>0.05),贮藏30 d时粒径增大(p<0.05),Zeta电位绝对值降低(p<0.05),但在为期7、15、30 d的贮藏时间内纳米粒粒径皆小于200 nm,粒度分散指数小于0.2,Zeta电位绝对值大于15 mV,处于稳定的范围,说明制备的SC-GA纳米颗粒在溶液中可以保持良好的稳定性,不易解离与聚集。

表5 纳米粒粒径、Zeta电位随贮藏时间变化Table 5 Changes of particle size and zeta potential with storage time

图12 不同样品的红外光谱图Fig.12 FTIR spectra of different samples注:(a)SC,(b)GA,(c)SC与GA混合物,(d)SC-GA纳米粒。

2.8.2 荧光光谱分析 蛋白质是荧光体,其内源性荧光主要来自于色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)等氨基酸残基[34]。SC的荧光主要来自于Trp,且在 280 nm波长附近激发[35]。因此应用主要来源于色氨酸的SC自身荧光的猝灭可以研究水溶液中GA与SC分子间的相互作用的过程。图13显示了激发波长280 nm时,不同温度、不同浓度GA对SC溶液的荧光发射光谱的影响。从中可以看出SC中的色氨酸在发射波长364 nm左右出现峰值且SC与GA的相互作用并没有使色氨酸的荧光发射光谱发生位移,表明SC与GA之间的相互作用并没有改变色氨酸周围环境的极性,所以GA与SC之间的相互作用并没有使SC的构象发生改变[36]。相同温度,随着GA浓度的增加,色氨酸残基的荧光强度降低;相同GA浓度,随着温度的升高,色氨酸残基的内源荧光强度降低,表明GA与SC的相互作用使SC内源荧光规律性猝灭。

图13 GA浓度对SC荧光光谱的影响 Fig.13 Fluorescence quenching of SC affected by the concentration of GA注:a:25 ℃,b:35 ℃;SC浓度为0.5 mg/mL,1～10:GA浓度分别为0,0.5,1,2,3,4,5,6,8,10 mg/mL。

荧光猝灭类型有动态猝灭和静态猝灭,猝灭类型可根据 Stern-Volmer 方程进行判断[37]。

F0/F=Ksv[Q]+1=Kqτ0[Q]+1

式(1)

其中,F0和F分别表示加入和不加入猝灭剂时体系的荧光强度;[Q]为猝灭剂浓度(mol/L),Ksv为 Stern-Volmer 猝灭常数(L/mol),Kq为双分子猝灭速率常数(L·mol-1·s-1),各类荧光猝灭剂对生物大分子的最大猝灭常数约为2.0×1010L·mol-1·s-1,τ0为不存在猝灭剂时荧光大分子的平均寿命,一般约为10-8s[38]。

根据Stern-Volmer方程,以[Q]为自变量,F0/F为因变量,通过线性拟合得图14,由图中直线的斜率和τ0可得到不同温度条件下GA与SC相互作用的Ksv和Kq,结果见表6。由图14和表6可知,不同温度下,GA对SC荧光发射光谱的Stern-Volmer曲线都呈现一定的线性关系,且随着温度的升高,曲线斜率即Ksv减小,表明GA对SC的荧光猝灭为静态猝灭[39]。同时,猝灭剂对生物大分子的最大猝灭速率常数为2×1010L·mol-1·s-1[40],而不同温度下GA对SC的荧光猝灭速率常数Kq均大于此值,进一步说明GA对SC的荧光猝灭为静态猝灭。Wang等[41]研究毛木耳多糖和人血清白蛋白(HSA)相互作用时发现多糖对HAS的的荧光猝灭也为静态猝灭。

表6 不同温度下GA与SC相互作用的Stern-Volmer方程常数和曲线拟合方程Table 6 Stern-Volmer quenching constants and curves fitted equation of interaction between GA and SC at different temperature

表7 不同温度下GA与SC相互作用的结合常数和曲线拟合方程Table 7 Binding constants and curves fitted equation of interaction between GA and SC at different temperature

图14 不同温度条件下GA对SC荧光猝灭的Stern-Volmer曲线Fig.14 Stern-Volmer plots of SC quenched by GA at different temperatures

静态猝灭过程中,分子之间的结合常数和结合位点数可根据以下双对数方程[42]得到:

lg [(F0-F)/F]=lgKa+nlg[Q]

式(2)

其中,F0和F分别表示加入和不加入GA时体系的荧光强度;[Q]为GA浓度(mol/L);Ka为表观结合常数;n为结合位点数;[Q]为猝灭剂的浓度(mol/L)。

根据方程式(2),以lg[(F0-F)/F]对lg[Q]作线性拟合得图15,计算得到不同温度条件下GA与SC相互作用的表观结合常数Ka和结合位点数n如表7所示。图15结合表7可知,GA与SC在25 ℃和35 ℃时均形成了结合位点数接近于1的复合物,且结合位点数和结合常数接近,均无显著差异(p>0.05),说明在常温下的水相体系中,适当升高温度对SC和GA相互作用的影响较小,而浊度-pH相图表明体系pH和离子强度极大地影响了复合物的形成,因此进一步印证了SC与GA之间形成纳米粒复合物的主要作用力为静电相互作用[5]。与此同时,两个温度下的水相体系中,二者的结合常数均在104～105L·mol-1之间,说明与配体-蛋白质特异性比较,SC与GA之间的静电相互作用属于亲和性比较低的[43]。Hu等[44]研究酪蛋白磷酸肽(CPP)和壳聚糖(CS)静电相互作用形成纳米粒时发现CS和CPP之间的结合也属于低亲和性的。

图15 不同温度条件下GA对SC荧光猝灭的双对数曲线Fig.15 Double logarithmic curves of SC quenched by GA at different temperature

3 结论

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Studies on the interaction of sodium caseinate and gum arabic and preparation of nanoparticles

LIU Chun-hua1,2,ZHOU Ai-mei1,2,*,YANG Ran1,PENG Dan-ying1,LIU Xin1,2,CAO Yong1,2

(1.College of Food Science of South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China; 2.Guangdong Province Engineering Research Center for Bioactive Natural Products,Guangzhou 510642,China)

In this paper,the effects of pH,the concentration ratio of sodium caseinate(SC)to gum arabic(GA),the total concentration of SC and GA and the ionic strength(the concentration of NaCl)on the interaction between SC and GA and the formation of nanoparticles were investigated by the characterization of turbidity,particle size and zeta potential. The morphological attributes of the nanoparticles were characterized by transmission electron microscopy(TEM)and the storage stability of nanoparticles was studied. Furthermore,the mechanism of the formation of nanoparticles formed by interaction between SC and GA was researched by infrared spectroscopy(FTIR)and fluorescence spectroscopy. The results revealed that pH and ionic strength greatly influenced the interaction between SC and GA and the formation of nanoparticles,indicating that the main force to form nanoparticles between SC and GA was electrostatic interaction. Meanwhile,the formation of stable nanoparticles was achieved under the following conditions:the concentration ratio of SC to GA was 1∶1,pH was 4.2,the total concentration of SC and GA was 3.0 mg/mL and the concentration of NaCl was 10 mmol/L. The particle size of resulted nanoparticles was about 142 nm and zeta potential was about-21.43 mV. Moreover,the nanoparticles remained stable after storage of one month at 4 ℃. TEM results showed that the nanoparticles were spherical in shape. FTIR results confirmed that electrostatic interaction occured in positively charged amino of SC and negatively charged carboxyl of GA. The fluorescence spectra results demonstrated that the combination between SC and GA to form nanoparticles by electrostatic interaction was low affinity.

sodium caseinate;gum arabic;interaction;nanoparticle;stability;mechanism

2017-03-06

刘春花(1992-)，女，硕士研究生，研究方向：食品化学与营养，E-mail：liuch0805@126.com。

*通讯作者:周爱梅(1971-)，女，博士，教授，研究方向：水产品及农产品深加工研究，E-mail:zhouam@scau.edu.cn。

TS201.2

A

1002-0306(2017)15-0068-011

10.13386/j.issn1002-0306.2017.15.015