三阴性乳腺癌中c- myc蛋白的表达及其与术后复发转移的关系

杨庄青 李 梅 王建逵 杨晓娟 陈 芸

(昆明医科大学第三附属医院 云南省肿瘤医院乳腺外二科，云南 昆明 650118)

三阴性乳腺癌中c- myc蛋白的表达及其与术后复发转移的关系

杨庄青 李 梅1王建逵 杨晓娟 陈 芸1

(昆明医科大学第三附属医院 云南省肿瘤医院乳腺外二科，云南 昆明 650118)

目的 探讨三阴性乳腺癌(TNBC)中c- myc蛋白的表达及其与术后复发转移的关系。方法 选取60例TNBC患者(TNBC组)及60例同期非TNBC患者(非TNBC组)，另选取同期乳腺增生患者30例为对照组，比较三组乳腺组织中c- myc蛋白的表达情况。分析c- myc蛋白的阳性表达与临床病理指标的关系，采用无病生存期(DFS)分析患者术后3年复发转移的情况。结果 TNBC组乳腺组织中c- myc蛋白的阳性表达率显著高于非TNBC组及对照组，非TNBC组亦高于对照组(P<0.05)；c- myc的表达与TNM分期、组织学分级、淋巴结转移有明显的关系(P<0.05)。c- myc阳性表达者术后3年DFS的比例显著低于c- myc阴性表达者(P<0.05)。结论 c- myc在TNBC患者中高表达，且和TNM分期、组织学分级、淋巴结转移和术后复发及转移相关，c- myc过度表达的患者术后出现复发与转移的风险更高，可能参与术后癌症复发与远处转移的分子过程。

c- myc蛋白；三阴性乳腺癌；复发转移；无病生存期

三阴性乳腺癌(TNBC)是雌激素受体(ER)、人表皮生长因子受体(HER)- 2、孕激素受体(PR)均为阴性的一种特殊亚型乳腺癌，发病率占乳腺癌的15%～25%，具有生物学特性高危、预后差的特点〔1〕。研究表明〔2〕，TNBC比其他乳腺癌更快发生远处转移和复发，因此TNBC患者术后复发转移的预测指标成为临床研究重点。c- myc是一种常见的原癌基因，能促进细胞分裂和增殖，主要由扩增以及染色体易位重排的方式激活，已被证实在乳腺癌等多种癌症中都表现出异常的高表达。本研究旨在探讨c- myc蛋白的表达及其与术后复发转移的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取云南省肿瘤医院2010年12月至2013年12月TNBC患者癌组织标本60例为TNBC组，选择同期非TNBC患者60例为非TNBC组。纳入标准：①ER、PR和HER- 2均为阴性；②患者均经过病理诊断确诊；③所有患者临床资料完整且知情同意。排除标准：①术前存在远处转移者；②术前接受内分泌治疗者；③省外不方便随访者；④随访期间死于其他疾病者。年龄60～82〔平均(66.3±4.1)〕岁；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期32例，Ⅲ期28例；组织学分级：Ⅰ+Ⅱ级39例，Ⅲ级21例；病理类型：浸润性导管癌46例，非浸润性导管癌14例；淋巴结转移：有46例，无14例。非TNBC组年龄60～79〔平均(65.2±5.3)〕岁；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期37例，Ⅲ期23例；组织学分级：Ⅰ+Ⅱ级35例，Ⅲ级25例；淋巴结转移：有40例，无20例。两组年龄、临床分期、组织学分级、淋巴结转移比较无显著差异(P>0.05)。另外选择同期本院收治的乳腺增生患者乳腺组织30例作为对照组，年龄61～81〔平均(25.1±4.3)〕岁。三组年龄比较无统计学差异(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 试剂 兔抗人c- myc蛋白单克隆抗体、抗体稀释液、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、c- myc荧光原位杂交试剂盒及其他试剂均来源于福州迈新生物科技有限公司。

1.2.2 荧光原位杂交技术(FISH)法 采用FISH检测c- myc基因扩增情况：①取10 ml组织细胞保存液，1 300 r/min离心10 min，去除上清后，滴入胶原酶B溶液3 ml，37℃水浴20 min，1 300 r/min离心10 min，行低渗处理，加入2 ml固定液，混匀后1 300 r/min离心10 min，重复滴加固定液后离心，待液体微浑浊后悬滴至载玻片，自然晾干。②在玻璃片上滴加探针混合液10 μl，盖玻片覆盖，置于铝盒中75℃水浴5 min，后置于42℃环境内16 h。③去除盖玻片置于洗涤液中洗涤2 min，置于70%乙醇中洗涤3 min，复染后暗处放置20 min。④用荧光显微镜观察。

1.2.3 免疫组化 链霉菌抗生物素蛋白- 过氧化物酶链接(SP)法，①脱蜡和水化：开始脱蜡前组织芯片在室温放置60 min后，连续采用二甲苯浸泡20 min，分2次，接着置于无水乙醇5 min，然后采用甲醛固定和石蜡包埋组织芯片，贴附于经过玻片硅化试剂盒(APES)处理的防脱磨砂玻片，置于-70℃恒温孵育器孵育2 h，之后进行免疫组化学染色。②免疫组化学染色：提前配合好磷酸盐缓冲液(PBS)、柠檬酸抗原修复液、1%盐酸酒精；将组织片放入3个装有二甲苯溶液中分别浸泡15 min进行脱蜡；再依次放入无水乙醇溶液中，浸泡5 min，依次放入90%乙醇、85%乙醇、75%乙醇的玻璃缸，每缸浸泡2 min，最后放入自来水、蒸馏水中清洗，完成水化过程；③抗原修复和封闭内源性过氧化氢酶：将切片浸入1×柠檬酸- 磷酸氢二钠缓冲液中，高压煮沸后继续加热2 min，然后停止加热让切片自然冷却；放入3% H2O2溶液的玻璃缸中，浸泡15 min、放入蒸馏水的玻璃缸中清洗，重复3次、放入PBS的玻璃缸中，浸泡5 min。④抗体杂交：甩去PBS余液，将组织片平铺在湿盒中，加正常山羊血清1滴20 μl，28℃放置20 min，甩干；加稀释好的一抗1滴，置于湿盒4℃过夜，置于PBS的玻璃缸中，缓慢振荡清洗5 min。生物素耦联的二抗20～50 μl，放置湿盒，37℃放置20 min。⑤显色：加链亲和素- 辣根过氧化物酶20～50 μl，湿盒内28℃放置5～20 min，甩干、置于PBS玻璃缸中，缓慢振荡清洗5 min，更换PBS，同法操作3次，甩干、滴加新鲜配制的DAB工作液100 μl(以覆盖组织为宜)，放置观察反应部位呈现黄褐色时(3～5 min)，置装有自来水玻璃缸中涮洗3次。⑥复染：置于苏木精溶液中复染5 min，然后反复自来水冲洗水不变色，接着采用酸酒精分化2 s，反蓝水洗2 min。⑦脱水、透片及封片：置入95%乙醇溶液，浸泡5 min，无水乙醇2次，每次5 min，再放入二甲苯的溶液中，浸泡5 min，滴加适当中性树胶，封片，晾干。

1.2.4 结果判定 采用盲法连续观察2个高倍视野，计数200个细胞。c- myc蛋白阳性表达为胞核呈棕黄色颗粒，用半定量计分方法，将染色强度分为无色(0分)、浅黄色(1分)、棕黄色(2分)、棕褐色(3分)，将阳性细胞比例分为<5%(0分)、5%～25%(1分)、26%～50%(2分)、51%～75%(3分)、>75%(4分)。将染色强度和阳性细胞比例的评分相乘，定义0分为-、1～4分为+；5～8分为；9～12分为，+、、均为阳性〔3〕。

1.3 随访 TNBC患者均进行门诊或电话随访，随访时间3年以上，患者术后复发转移的情况用无病生存期(DFS)进行反映，DFS即从手术时间到证实癌症复发转移的时间。

1.4 统计学方法 应用SPSS17.0软件进行χ2、t检验，采用Kaplan- Meier法绘制生存曲线。

2 结 果

2.1 各组乳腺组织中c- myc蛋白阳性表达率比较 TNBC组(76.67%，-14例，+12例，20例，14例)、非TNBC组(43.33%，-34例，+12例，8例，6例)乳腺组织中c- myc蛋白阳性率显著高于对照组(6.67%，-28例，+1例，1例，0例)，TNBC组高于非TNBC组(P<0.05)。

2.2 c- myc的表达与TNBC患者临床病理指标的关系 c- myc阳性表达与TNM分期、组织学分级、淋巴结转移和术后复发及转移相关(P<0.05)。见表1。

表1 c- myc的表达与临床病理指标的关系〔n(%)〕

2.3 c- myc阳性、阴性TNBC患者术后3年DFS比较 c- myc阳性表达者术后3年DFS的比例为54.42%，阴性表达者为85.71%，两组比较有显著差异(χ2=4.467，P=0.034)。见图1。

图1 c- myc阳性、阴性TNBC患者术后3年DFS分析

3 讨 论

乳腺癌包括正常乳腺样型、HER- 2过表达型、luminalA型、luminalB型、基底细胞样乳癌(BLBC)等5个亚型，而TNBC在基因水平、免疫表型、临床特征等多个方面都与BLBC表现出了高度相似性，二者存在紧密的联系，71%～91%的TNBC可归于BLBC，而80%的BLBC属于TNBC〔4〕。BLBC的生物学行为比其他类型乳腺癌更恶劣，常规标准治疗的疗效一般，又缺乏内分泌治疗与靶向治疗，无论处在何种分期均存在较高的侵袭性，容易发生远处转移，预后比其他类型乳腺癌更差。陈洪流〔5〕报道，非TNBC患者的3年存活率可达到90.4%，而TNBC患者仅有76.2%。

c- myc是较早发现的一种原癌基因，位于人染色体8q24，是一种序列特异性转录因子。研究表明，其在宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等中都表现出了基因扩增、重排的情况〔6〕。c- myc在ER阴性的乳腺癌中往往更先发生扩增与过度表达，扩增率达30%左右，而且一般为组织学分级高，预后差。Chen等〔7〕研究表明，乳腺癌的c- myc基因扩增率高于非典型增生，更高于良性增生，提示在c- myc基因过度表达参与了肿瘤发生发展的整个过程。谢静静等〔8〕研究显示，TNBC乳腺组织中c- myc蛋白的阳性表达率明显高于非TNBC，这与本研究结果基本一致，说明TNBC与其他类型乳腺癌在分子标志物表达水平上存在一定的特殊性，c- myc基因表达可作为寻找药物靶点的突破口。

相关报道指出〔9〕，组织学分级Ⅲ级的TNBC患者出现c- myc阳性表达的概率是Ⅰ～Ⅱ级患者的3.1倍，有淋巴结转移的TNBC患者是无淋巴结转移患者的2.5倍，提示组织学分级越高或有淋巴结转移则c- myc阳性表达越明显。本研究结果显示，c- myc的表达与TNM分期、组织学分级、淋巴结转移和术后复发及转移密切相关。究其原因，c- myc主要以二聚体的形式存在，能对靶基因的转录进行调控，能通过抑制生长抑制基因转录实现对细胞周期的调控，当c- myc表达增多时，可加速细胞由G1期进入S期，从而促进细胞分裂和加速细胞凋亡。

生存曲线说明c- myc过度表达的患者术后出现复发与转移的风险更高，与Tanino等〔10〕研究结果一致，提示c- myc过度表达可能对术后癌症复发与远处转移有关。经典wnt- β- Catenin信号通路中的任何信号分子正常与否都与肿瘤的发生息息相关，研究表明，TNBC的发生与下游重要靶基因c- myc在这个通路中过度表达有一定的联系，但目前尚未完全明确其中的作用机制〔11〕。

作为具有高危生物学行为及临床病理特征、缺乏有效的治疗靶点、预后差的一个乳腺癌亚型，TNBC的术后复发转移及其中的分子生物学机制应得到更多的研究，后期应扩大样本量，延长随访时间，争取尽早从基因表达的水平上为靶点治疗提供新的思路。

1 张 毅,王 燕,王 伟,等.青年女性三阴性乳腺癌的临床病理学特征及其影响预后的多因素分析〔J〕.现代生物医学进展,2014;14(11):2092- 9.

2 郭海峰,李铁灵,孙治国,等.在三阴性乳腺癌组织中环氧合酶- 2、核因子- κB及血管内皮生长因子的表达〔J〕.中华实验外科杂志,2016;33(4):942- 4.

3 余 峰,张霄蓓,张 晟,等.三阴性乳腺癌复发特征及危险因素分析〔J〕.中华医学杂志,2014;94(28):2180- 3.

4 张 宏,王 文,田 甜,等.Ezrin在三阴性乳腺癌中的表达及意义〔J〕.西安交通大学学报(医学版),2016;37(4):574- 7.

5 陈洪流.三阴性乳腺癌患者的临床特征及预后因素〔J〕.中国老年学杂志,2013;33(23):5840- 1.

6 Schüler- Toprak S,Häring J,Inwald EC,etal.Agonists and knockdown of estrogen receptor β differentially affect invasion of triple- negative breast cancer cells in vitro〔J〕.BMC Cancer,2016;16(1):951.

7 Chen B,Dai D,Tang H,etal.Pre- treatment serum alkaline phosphatase and lactate dehydrogenase as prognostic factors in triple negative breast cancer〔J〕.J Cancer,2016;7(15):2309- 16.

8 谢静静,苏永辉,姜永冬,等.ki67在三阴性乳腺癌中的临床病理意义〔J〕.国际免疫学杂志,2016;39(3):218- 21.

9 方 明,康 乐,陈英杰,等.Smoothened、STAT3和MMP- 9在三阴性乳腺癌中的表达及临床意义〔J〕.中国免疫学杂志,2014;30(6):821- 4,830.

10 Tanino H,Kosaka Y,Nishimiya H,etal.BRCAness and prognosis in triple- negative breast cancer patients treated with neoadjuvant chemotherapy〔J〕.PLoS One,2016;11(12):e0165721.

11 马 涛,张君莹,吴建中,等.miR- 342- 3p对三阴性乳腺癌化疗敏感性的影响〔J〕.中南大学学报(医学版),2014;39(5):488- 95.

〔2017- 01- 07修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

云南省卫生科技计划项目(No.2014NS021)

杨庄青(1974- )，女，硕士，副教授，主要从事乳腺肿瘤研究。

R73

A

1005- 9202(2017)15- 3789- 03；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.065

1 昆明医科大学第三附属医院 云南省肿瘤医院病理科