冠心病患者血液循环miR- 126表达及与阿司匹林抵抗的关系

刘 卓 赵艳晶 汪 晶 陶英歌

(牡丹江医学院第二附属医院心血管内一科，黑龙江 牡丹江 157000)

冠心病患者血液循环miR- 126表达及与阿司匹林抵抗的关系

刘 卓 赵艳晶 汪 晶 陶英歌

(牡丹江医学院第二附属医院心血管内一科，黑龙江 牡丹江 157000)

目的 探讨冠心病(CHD)患者血液循环微小RNA(mi)- 126的表达及与阿司匹林抵抗(AR)的关系。方法 收集牡丹江医学院第二附属医院2015 年3月至2017年1 月的CHD患者106例，选择同期在院内的健康体检志愿者51例作为对照。检测所有受试者的血小板聚集率并判断是否存在AR，采用RT- PCR法检测血小板的miR- 126表达，并分析miR- 126与AR的相关性。结果 与对照组比较，CHD组AR的发生率较高(P=0.005)，血小板的miR- 126明显降低(P=0.000)。与对照组的AR和非AR(NAR)亚组比，CHD的AR和NAR亚组miR- 126水平均明显降低(P=0.000)。结论 CHD患者血小板 miR- 126 水平低于健康人，与AR存在相关性，血小板 miR126 水平降低可能会增加健康人群发生CHD的发生。

冠心病；miR- 126；阿司匹林抵抗

临床常采用具有抗血小板聚集的阿司匹林预防冠心病(CHD)血栓事件发生。近年来，人们发现不同CHD患者对于阿司匹林的治疗反应或效果存在差异，致使血栓事件发生频繁，这种现象被称为阿司匹林抵抗(AR)〔1〕。流行病学统计显示AR在心血管病患者的发生率高达40%。目前所发现的人类基因组30 亿个核苷酸碱基对内，非编码 RNA 基因，即微小 RNA(miR) 仅占整个基因组 1%，但人类基因组中约有1/3的基因受到miR调控。miR可调控血小板内 mRNA 表达，影响血小板的活性。miR- 126〔2〕、miR- 34a〔3〕和miR- 92a〔4〕常作为血管疾病的生物学标志，其中miR- 126与血小板的活性密切相关。本课题拟考察CHD患者血液循环miR- 126表达及AR的关系。

1 对象和方法

1.1 对象 经牡丹江医学院第二附属医院伦理委员会批准，并经过患者签署知情同意书，收集2015 年3月至2017年1 月经WHO临床命名标准化联合专题组提出的《缺血性心脏病的命名及诊断标准》中对CHD的诊断标准〔5〕并结合冠脉造影确诊的CHD患者106例，主诉反复胸部闷痛，气短，头晕，时伴有心悸，疲劳时可加剧，经休息可缓解。其中男67例，女39例，年龄(73.16±9.87)岁。患者均服用小剂量阿司匹林100 mg/d超过3个月，无胃肠出血迹象或者症状。纳入标准：符合CHD诊断标准，冠状动脉造影检查提示左冠脉主干、右冠脉、左前降支和回旋支中有任意一支直径狭窄程度>50%者；无阿司匹林过敏史者；未接受过血运重建治疗者；预计生存期>6个月；配合检查和治疗。排除标准：存在家族或个人出血史，如原发性血小板减少性紫癜、肝胆疾病和血管硬化性出血；合并血液系统疾病或恶性肿瘤患者；存在严重的肺、肝和肾功能障碍者；存在阿司匹林口服禁忌证者。选择同期在院内的健康体检志愿者51例作为对照，其中男35例，女16例，平均年龄(72.65±10.32)岁。对照组在入选前2 个月内未服用过影响血小板活性的药物。

1.2 主要仪器及试剂 ABI QuantstudioTMDX定量PCR仪(美国 ABI 公司)；5400型全自动生化分析仪(美国贝克曼公司)；700型全自动血小板聚集仪(上海博士仪器有限公司)；LBY- NJ4A型全自动血小板聚集仪(北京普利生仪器有限公司)。Trizol 总RNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司)，逆转录试剂盒和PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司)；内参引物和miR- 19a(美国 Invitrogen公司)，花生四烯酸(AA) (美国 Invitrogen公司)。

1.3 指标检测

1.3.1 一般指标 收集所有受试者的性别、年龄、体重指数、吸烟和喝酒情况，检测血压，抽取所有受试者空腹血5 ml，抗凝处理，离心获得血浆，分别采用全自动生化仪检测血脂和血糖及LBY- NJ4A型全自动血小板聚集仪检测血小板计数。

1.3.2 血小板聚集率 参考血小板聚集仪说明书及文献〔6〕，收集所有受试者的空腹静脉血5.0 ml，平均分为两份，分别置于取2.5 ml置于抗凝管(抗凝剂∶血液=1∶9)，500 r/min离心5 min，获得富血小板血浆，3 000 r/min离心10 min，得乏血小板血浆(PPP)。以PPP为对照，采用全自动血小板聚集仪测定血小板聚集功能，将0.5 mmol/L AA为诱导剂，AA诱导的血小板聚集率≥20% 即为AR，20%为非CHD(NAR)。

1.3.3 RT- PCR法检测血小板的miR- 126表达 收集所有患者的富血小板血浆，检测血小板的miR- 126表达。血小板沉淀按miRcute miRNA 提取试剂盒提取miRNA。采用茎环引物行反转录反应：2.0 μl RT buffer，2 μmol/L Primer 0.5 μl，6.25 μl RNA，0.5 μl dNTP，0.5 μl M- MLV，0.5 μl Rnase inhibitor，RNase- Free dd H2O加入至20 μl。逆转录循环条件：16℃ 15 min，35℃ 60 min，80℃ 15min。 hsa- miR- 126 引物序列：正义5′- GCCCTCGTACCGTGAGTAAT- 3′，反义5′- GTGCAGGGTCCGAGGT- 3′。荧光定量PCR反应：miRNA PCR 反应终体积20 μl，包括2×Super Real Pre Mix 10 μl、上下游引物共 0.3 μmol/L、cDNA模板2.5 μl，同设阴性对照。PCR反应设置程序：95℃ 变性2 min，95℃变性20 s，6℃退火20 s，72℃延伸1 min，共40个循环。经软件分析CT值，最终结果以2-ΔCT表示。

1.4 统计学方法 应用SPSS20.0软件进行t及χ2检验。

2 结 果

2.1 两组一般情况比较 两组性别、年龄、体重指数、吸烟喝酒、舒张压、血脂、血糖和血小板计数差异无统计学意义(P>0.05)，与对照组比较，CHD患者收缩压较高(P<0.05)。见表1。

表1 两组一般情况比较

2.2 两组AR发生情况 对照组出现AR 10例(19.61%)，CHD组出现45例(42.45%)，两组比较差异有统计学意义(χ2=7.895，P=0.005) 。

2.3 两组miR- 126表达 对照组血小板miR- 126的相对表达(0.34±0.09)显著高于CHD组(0.12±0.04，t=21.232，P=0.000)。

2.4 两组AR和非AR(NAR)亚组血小板miR- 126水平比较 对照组AR亚组miR- 126水平(0.49±0.10)低于NAR亚组(0.30±0.12)，CHD组AR亚组miR- 126水平低于NAR亚组(0.14±0.04)，与对照组的AR和NAR亚组比，CHD的AR和NAR亚组miR- 126水平均明显降低(P=0.000)。

3 讨 论

血小板在CHD发生血栓栓塞事件的作用越来越明确，血小板与血管内皮释放的黏连蛋白结合，启动血栓形成，因此抗血小板治疗成为CHD预防心血管事件发生的重要手段。阿司匹林是临床最常用的抗血小板药，病人应用常规剂量的阿司匹林仍会发生血栓事件，即不良心血管事件(MACE)，检查标明血小板的活化及聚集功能未得到充分抑制，即AR现象，AR的发生率较高，临床后果较严重，因此早期判断患者是否存在AR，通过替换给药方案则有望改善CHD患者预后〔7〕。本研究提示存在AR的患者如果仍然继续使用阿司匹林，抗血小板聚集的功能降低，AR患者发生MACE的概率远高于NAR患者，严重影响患者的生存质量，这也是CHD患者即使接受冠状动脉介入治疗(PCI)后继发支架内血栓的重要原因。

miR- 126的基因位于血管内皮细胞特异性表达基因的第7个内含子，最早在小鼠心脏和小脑中发现，miR- 126可调节内皮细胞的多种生理功能，对于造血、呼吸、消化、生殖甚至胚胎均有一定功能，尤其在心血管的功能备受关注。miR- 126在 CHD 的发生发展过程中扮演重要角色〔8〕。本课题结果提示血小板miR- 126与AR呈负相关，即miR- 126水平越低，AR的发生率越高，血小板miR126的减少不仅可增加健康人发生AR的概率，也可增加健康人发生CHD的风险。本文及文献报道均显示血小板miR- 126与AR关系紧密，可用于预测人群的AR发生，尤其可用于CHD用药指导〔9〕。miR- 126水平与 CHD 病变的关系较为复杂，大致可分以下4 个方面〔9〕：(1)血管内皮生长因子(VEGF)参与 CHD及动脉粥样硬化(AS)的发生发展，miR- 126通过直接抑制出芽相关蛋白1(SPRED1)和磷酸肌醇3激酶调控亚单位(PIK3R2)/p85- β的表达负性调节内皮细胞对VEGF的应答，下调的miR- 126失去了对 VEGF 的抑制，因此有学者认为miR- 126可作为抗AS的潜在靶点；(2) CHD的发生起始于血管内皮受损导致功能障碍，血管内皮受自始至终伴随在CHD发展全过程，细胞黏附因子(VCAM)- 1是参与并促进CHD发展过程的AS早期斑块形成的关键因子。VCAM- 1是miR- 126的靶基因，当敲除miR- 126反义寡核苷酸，VCAM- 1的表达增高；(3)CHD是慢性炎症性疾病，许多炎症细胞和炎症因子参与其中，miR- 126可下调肿瘤坏死因子(TNF)- α表达，抑制TNF- α诱导的白细胞在血管内皮的黏附，促使动脉斑块面积缩小，增高胶原蛋白，达到抑制内皮细胞炎症反应的发生；(4)miR- 126是血管生成信号通路中的正调节因子，miR- 126可编码类表皮生长因子域(EGFL)7基因内含子，EGFL7可编码VEGF，因此上调miR- 126表达可促进血管生成，改善并修复损伤血管细胞，确保血管完整，敲除斑马鱼的miR- 126可抑制血管迁移，干扰生长信号，破坏血管内膜完整性。

CHD患者血小板miR- 126与AR具有明显的相关性，提示miR- 126可能具有促进血小板的活化和聚集的作用，研究也显示阿司匹林的应用可降低循环miR- 126水平，进一步为miR- 126参与CHD提供了证据〔10〕。虽然研究认为在血小板表达的miR可改变血小板基因表达，如血小板内Ago2免疫沉淀物可检测到miR- 223，即P2Y12的 mRNA 在 3′端 UTR 可以被miR识别，miR- 223与3′ 端 UTR结合并形成 Ago2- miR- 223 复合体反过来调节 P2Y12的表达〔11〕。但miR- 126对血小板基因影响尚不明确，有待进一步探索。李娜〔12〕认为miR- 126在稳定型心绞痛的表达低于不稳定型心绞痛，是否提示miR- 126在不稳定型心绞痛水平增高是一种机体对心绞痛病理的代偿性保护作用，仍需要提供更多数据支持。另外，除了miR- 126，血小板中有超过300个不同的 mRNA，这些miR均有可能不同程度地参与调控血小板基因表达，这些不同的 mRNA也存在不同程度地交互作用，如血栓素激活1 h的血小板中miR- 15a的表达下调，但miR- 365的表达上调〔3,4〕，可见不同的 mRNA的相互作用复杂多变，因此仅考察miR- 126或多个miRNA均可能存在不同程度的偏颇。

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12 李 娜.冠心病患者血小板相关microRNA的表达及其意义〔D〕.蚌埠：蚌埠医学院,2014.

〔2017- 06- 11修回〕

(编辑 袁左鸣)

陶英歌(1979- )，女，主管护师，主要从事消化内科研究。

刘 卓(1983- )，女，主管护师，主要从事心血管疾病研究。

R741.02

A

1005- 9202(2017)15- 3707- 03；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.028