自噬在肾脏结石大鼠发病中的作用机制

高炜城 王 森 白 亮 郑祥光 罗 力 李 峻

(广东药科大学附属第一医院泌尿外科，广东 广州 510080)

自噬在肾脏结石大鼠发病中的作用机制

高炜城 王 森 白 亮 郑祥光 罗 力 李 峻

(广东药科大学附属第一医院泌尿外科，广东 广州 510080)

目的 探讨自噬在肾脏结石发病中的作用机制。方法 建立腺嘌呤摄入过量引发的肾结石小鼠模型，通过对小鼠血液、尿液、肾脏组织样本收集，运用分子生物学方法检测小鼠血液中肌苷酸含量、小鼠体重、肾比重、一昼夜尿液量、小鼠尿液中微量蛋白含量及肾脏组织自噬基因mRNA和自噬相关蛋白的表达情况，并运用生物统计学进行数统计。结果 腺嘌呤模型小鼠体重下降，肾比重和一昼夜排尿量比对照组较高，酶联免疫吸附(ELISA)结果显示腺嘌呤模型小鼠血液中肌苷酸的含量，尿液中微量蛋白的含量与对照组相比升高，同时PCR及蛋白免疫印迹结果证明自噬相关mRNA和蛋白表达量的变化，自噬抑制剂处理小鼠后，肾结石症状稍有缓解，自噬相关mRNA和蛋白表达量的也发生调整。结论 证明2，8二羟基腺嘌呤结石的积累可以引起肾组织自噬发生，导致肾结石相关症状。

腺嘌呤；肾结石；自噬

肾结石是尿路最常见疾病之一，临床表现症状为腰痛和血尿，严重影响肾结石患者的生活质量〔1〕。肾结石与慢性肾病密切相关，已成为慢性肾病进展为终末期肾病的风险因子〔2〕。研究表明在已报道的慢性肾病中(如肾炎，肾脏纤维化，肾癌等)有自噬发生〔3〕，自噬相关基因mRNA、蛋白表达量也发生变化。近期研究报道，小鼠中腺嘌呤磷酸核糖转移酶的缺失和口服腺嘌呤的摄入过多〔4〕，导致8- 二羟腺嘌呤不溶性结晶在肾小管中大量积累，进一步导致肾组织纤维化和肾功能紊乱。然而，8- 二羟腺嘌呤诱导肾脏纤维化和肾脏结石中精确的调控机制并不完全明确。目前的研究显示，腺嘌呤小鼠可能是由单核细胞/巨噬细胞参与纤维化的过程引起的〔5〕。腺嘌呤喂食7 d后，尿结石在小管沉积产生。随着时间推移，腺嘌呤喂养的小鼠血清中肌酐水平升高和体重降低，暗示腺嘌呤喂养引发典型的肾脏功能障碍。同时在肾组织中发现，自噬相关mRNA和蛋白的表达水平升高。本文主要以腺嘌呤诱导肾结石模型，研究自噬抑制剂对肾结石的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 细胞内RNA抽提试剂TRIzol、M- MLV反转录试剂盒(Invitrogen公司)，酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(R&D Systems公司)，PVDF膜(Millipore公司)，丽春红、三氯乙酸和磺基水杨酸、腺嘌呤、3- 甲基腺嘌呤(3- MA，Sigma公司)，蛋白印迹化学发光试剂(Thermo Scientific公司)，X- Omat光片购自(Kodak公司)，4℃或-20℃冰箱(海尔)，微量移液器(Eppendorf公司)，垂直电泳槽、湿转转膜仪和配套电源(Bio- Rad或Amersham Biosciences公司)，冷冻离心机(Eppendorf公司)，高速离心机(Beckman公司)，PCR仪(东胜创新公司)，实时荧光定量PCR系统(Applied Biosystems公司)，精密天平(Mettler Toledo公司)。

1.2 动物实验 雄性野生型C57BL/6小鼠购自上海拜力生物科技公司。腺嘌呤过量摄入构建肾结石小鼠模型：6周龄小鼠分成4组，一组按实验室标准正常进食，另一组食物添加0.25%的腺嘌呤，第3组小鼠每周腹腔注射一次50 μl 3- MA，第4组食物中添加0.25%的腺嘌呤的同时每周腹腔注射一次50 μl 3- MA〔6〕。在7、14、2、28 d时对小鼠进行安乐死处理、然后收集小鼠血液和肾脏。实验结束前24 h，把小鼠放进代谢笼，禁食不禁水，收集实验前24 h小鼠尿液。动物房保持温度22℃±3℃，湿度(35±5)%，12 h昼夜周期(早上6：30亮灯)。动物实验操作方法和程序都得到我院实验动物管理和使用委员会批准。

1.3 蛋白提取 50 mg左右的组织或贴壁细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗2遍并吸尽残余的PBS，加适量体积的混有蛋白酶抑制剂和磷脂酶抑制剂的变性RIPA裂解液〔150 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris pH7.2，0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)，1% Triton X- 100，1% Deoxycholate，5 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)〕，冰上充分裂解后转移至EP 管。4℃，12 000 r/min离心20 min，取上清，用Pierce公司的BCA Kit测蛋白浓度。测完浓度后，加4×SDS loading buffer(200 mmol/L Tris- HCl，pH6.8，8% SDS，0.4%溴酚蓝，40%甘油，400 mM DTT)，100℃煮10 min，立即上样进行免疫印迹检测或-20℃贮存。

1.4 免疫印迹 根据蛋白分子量的不同，选用适合浓度的不连续变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS- PAGE)进行垂直电泳，一般为10%。开始以80 V的电压进行电泳，待染料前沿进入分离胶后将电压提高到120 V继续电泳，直到溴酚蓝到达分离胶的底部；然后按照阳极- 海绵- 滤纸- 聚偏氟乙烯(PVDF)膜- 胶- 滤纸- 海绵- 阴极的顺序安置好，放入转膜容器中，4℃，380 mA，转膜时间根据分子量不同而不同，一般为1.5 h。转膜结束后取出PVDF膜，标好方向和marker，按需裁剪。用10%脱脂牛奶室温封闭1 h，Tris盐酸缓冲液(TBST)洗3次，每次5 min。进行一抗反应，抗体配置在1×TBST+5% BSA中，室温1～2 h或4℃过夜，回收抗体，4℃保存。PVDF膜接下来继续用TBST洗3次，每次5 min，进行二抗反应，室温1 h后TBST洗膜3次，每次5 min。增强化学发光法(ECL)显色，暗房压片。

1.5 RNA提取及实时定量荧光PCR 细胞或组织样品RNA利用Invitrogen公司的TRIzol试剂来提取：细胞或组织加0.5 ml TRIzol破碎后室温孵育5 min，再加入0.2 ml氯仿，用力摇晃15 s后室温孵育5 min。4℃，12 000 r/min离心15 min，将上层的水相转移到一个新的1.5 ml离心管中，加入等体积异丙醇进行沉淀，室温孵育15 min。然后，4℃，12 000 r/min离心15 min，弃上清，底部的RNA沉淀用75%乙醇洗涤，4℃，7 500 r/min离心5 min后弃上清。室温挥发完残余乙醇后，将RNA沉淀溶解于焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的双氧水(ddH2O)。用Takara公司的RNase- free DNase I处理除去可能的DNA污染后，对RNA进行定量。取1 g RNA反转，得到cDNA。按照Takara公司逆转录系统提供的说明书，选用random primers和oligo T primer进行反转录，PCR反应条件为：37℃15 min，85℃15 s，4℃冷却。整个操作过程中严格避免RNA酶的污染。应用美国Applied Biosystems公司的SYBR Green I Master Mix试剂和ABI 7500或7900系统，对cDNA进行PCR扩增定量检测。

1.6 血液中肌苷酸水平测量 按照ELISA试剂盒说明书操作。

1.7 尿液微量蛋白水平检测 小鼠尿液样本离心，然后按ELISA试剂盒说明书进行操作。

1.8 统计学方法 应用SPSS软件进行t检验、one- way ANOVA及Student- Newman- Keuls检验。

2 结 果

2.1 自噬抑制剂对肾结石小鼠血液中肌苷酸水平影响 随着时间的推移，腺嘌呤过量摄入的肾结石模型小鼠血液中肌苷酸水平明显高于对照组，但腺嘌呤摄入同时自噬抑制剂3- MA处理的小鼠，血液肌苷酸水平下降，显著低于腺嘌呤摄入肾结石模型组，说明自噬抑制剂对肾结引起的高水平血液肌苷酸有降低作用。见图1。

1)P<0.05，2)P<0.01；下图同图1 自噬抑制剂对肾结石小鼠血液中肌苷酸水平影响

2.2 自噬抑制对肾结石小鼠体重和肾比重影响 随着时间推移，腺嘌呤过量摄入的肾结石模型小鼠的体重与对照组小鼠体重相比明显下降，但腺嘌呤摄入同时自噬抑制剂3- MA处理的小鼠体重基本恢复。随着时间推移，腺嘌呤过量摄入的肾结石模型小鼠的肾比重明显高于对照组小鼠肾比重，同时自噬抑制剂3- MA处理的小鼠肾比重下降。实验结果说明，腺嘌呤过量摄入肾脏确实发生变化，并且自噬抑制剂参与其中。见图2。

2.3 自噬抑制剂对肾结石小鼠尿液量和尿液中微量蛋白含量影响 14、28 d腺嘌呤过量摄入的肾结石模型小鼠一昼夜的排尿量及尿液中微量蛋白含量与对照组相比明显升高，并且自噬抑制剂3- MA处理肾结石模型小鼠能使小鼠排尿量及尿液微蛋白含量趋于正常。上述结果表明，腺嘌呤过量摄入的肾结石模型建立成功，跟对照组相比表现出血液肌苷酸含量升高，体重下降，肾比重升高，排尿量尿液及尿液中微蛋白含量升高的肾结石表征。且自噬抑制剂3- MA对腺嘌呤过量摄入的肾结石模型有调节作用。见图3。

2.4 自噬抑制剂对肾结石小鼠肾组织中自噬相关基因mRNA量的影响 14、28 d，腺嘌呤过量摄入的肾结石模型小鼠肾脏组织中，自噬相关基因mRNA表达量显著变化，LC3b mRNA表达水平升高、mTOR mRNA表达水平下降。说明腺嘌呤过量摄入的肾结石小鼠模型存在自噬的发生，且自噬抑制剂能控制腺嘌呤过量摄入的肾结石模型小鼠肾脏组织中自噬的表达。见图4。

图2 自噬抑制对肾结石小鼠体重和肾比重影响

图3 自噬抑制剂对肾结石小鼠尿液量和尿液中微量蛋白含量影响

图4 自噬抑制剂对肾结石小鼠肾组织中自噬相关基因mRNA量的影响

2.5 自噬抑制剂对肾结石小鼠肾组织中自噬相关蛋白表达量的影响 为了验证图4得出的结论，利用蛋白免疫印迹方法检测28 d肾脏组织中自噬相关蛋白的表达。与对照组相比，腺嘌呤过量摄入的肾结石模型小鼠肾脏组织中LC3b 蛋白表达水平升高，mTOR mRNA表达水平下降。自噬抑制剂同样能缓解肾脏组织中自噬情况，缓解肾结石的症状。见图5。

图5 自噬抑制剂对肾结石小鼠肾组织中自噬相关蛋白表达量的影响

3 讨 论

大多数肾脏疾病能发展到晚期肾小球硬化症或肾小管间质化硬化症，通常伴随着进行性肾脏功能紊乱〔7〕。类似的肾损伤通常与自噬相关，与白细胞和巨噬细胞组织和与相关趋化因子的表达增加及其受体有关。例如，巨噬细胞观察不仅在肾小球间质也区域在人类狼疮肾炎等肾脏疾病，IgA肾病和糖尿病肾病，表明巨噬细胞也扮演重要的角色〔8〕。自噬作为细胞内清理损伤细胞器的机制，与肾损伤、肾癌、肾炎、肾纤维化密切相关。

在哺乳动物中，腺嘌呤作为内源被聚胺通路的副产路，腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT EC 2.4.2.7)〔9〕。当缺乏时，腺嘌呤成为黄嘌呤脱氢酶的主要底物(EC 1.2.3.2 XDH)，它把腺嘌呤氧化成2，8二羟基腺嘌呤(DHA)〔10〕。因为DHA的溶解度很低，所以沉积在肾小管中，形成肾结石〔4〕。APRT缺乏的小鼠〔11〕，表现出肾结石症状，肾小管广泛扩张、炎症，坏死、自噬和纤维化，同时伴有肾脏功能障碍，这在单侧输尿管阻塞(UUO)模型中是看不到的〔12〕。长期喂食腺嘌呤诱发DHA沉积在小鼠鼠肾小管中，导致肾功能紊乱〔13〕。本文发现腺嘌呤模型小鼠血液中肌苷酸的量升高，体重下降，肾比重，一昼夜排尿量，尿中微量蛋白含量与对照组相比有都有所升高，同时检测到自噬相关mRNA和蛋白表达量的变化。自噬抑制剂处理小鼠后，肾结石症状稍有缓解，自噬相关mRNA和蛋白表达量的也发生调整。证明2，8二羟基腺嘌呤结石的积累，可以引起肾组织自噬发生，导致肾结石相关症状。同时，自噬抑制剂同样能缓解肾脏组织中自噬情况，缓解肾结石的症状，但具体影响机制有待探究。

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〔2017- 03- 11修回〕

(编辑 袁左鸣)

广东省医学科学基金资助项目(No.B2012085)

王 森(1970- )，男，副主任医师，主要从事泌尿系结石研究。

高炜城(1981- )，男，硕士，主治医师，主要从事泌尿系结石研究。

R692.4

A

1005- 9202(2017)15- 3699- 04；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.025