肺癌患者癌旁组织中上皮-间质转变相关蛋白表达对其预后的影响

卓 越 梁 冬

(海南省农垦三亚医院，海南 三亚 572000)

肺癌患者癌旁组织中上皮-间质转变相关蛋白表达对其预后的影响

卓 越 梁 冬

(海南省农垦三亚医院，海南 三亚 572000)

目的 探讨肺癌患者癌旁组织中上皮- 间质转变(EMT)相关蛋白表达对其预后的影响。方法 采用免疫组化法检测81例肺癌患者癌组织和配对癌旁组织中的EMT相关蛋白(E- cadherin、β- catenin和Vimentin)，观察E- cadherin、β- catenin和Vimentin在癌组织和癌旁组织中表达差异，并比较癌旁组织中E- cadherin、β- catenin和Vimentin表达差异下患者的预后情况，以患者的病理资料和EMT相关蛋白表达差异纳入Cox回归模型，预后因子采用多因素分析。结果 ①肺癌组织中E- cadherin和β- catenin阳性表达率(49.38%和14.81%)明显低于癌旁组织(72.84%和51.85%)，而Vimentin阳性表达率(55.56%)明显高于癌旁组织(23.46%)(均P<0.05)。②癌旁组织中E- cadherin阳性、β- catenin阳性和Vimentin阴性患者预后较E- cadherin阴性、β- catenin阴性和Vimentin阳性患者预后好(P<0.05)。③Cox回归分析发现临床分期、肿瘤分期、EMT- L和肿瘤分化程度是独立的风险预后因子。结论 EMT相关蛋白在癌旁组织中的表达异常对肺癌患者的预后有一定的影响，在癌症早期阶段及癌旁组织未发生明显组织形态学异常时，EMT相关蛋白的检测对患者的预后情况分析具有一定的参考价值。

肺癌；癌旁组织；E- cadherin；β- catenin；Vimentin

调查显示2008年我国肺癌发病率约为54.75/10万，死亡率约为46.07/10万，占全部恶性肿瘤死亡总数的24.95%〔1〕。肺癌的发病率和死亡率在全部肿瘤中增长最快〔2〕，属于高致病性疾病，并增加了医疗负担〔3〕。目前我国主要通过影像学、CT引导肺穿刺活检及支气管镜等诊断肺癌，但在确诊时75%患者都为晚期或发生转移〔4〕。近年来诊治技术不断提高，但肺癌患者的生存率却并未得到明显提高，复发转移是导致患者死亡的重要原因〔5〕，了解患者的预后有及其重要的意义。上皮- 间质转变(EMT)是指细胞由上皮表型向间质表型转化的现象，以上皮标志物E- cadlherin下降和间质标志物Vimentin上升为主要生物学特征，是一种基本的生理病理现象，是多数肿瘤侵袭转移早期的重要过程〔6〕。目前关于肺癌癌旁组织中EMT相关蛋白的表达差异对患者的预后有无影响并无明确定义。本研究探讨肺癌患者癌旁组织中EMT相关蛋白的表达情况对其预后的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取海南省农垦三亚医院2012年12月年至2014年1月在肿瘤科确诊的81例肺癌患者的癌组织、癌旁组织(距癌病灶距离≥5 cm)。男38例，女43例；年龄35～80(中位41)岁。TNM分期Ⅰ期25例、Ⅱ期19例、Ⅲ期23例、Ⅳ期14例。纳入标准：①患者术前未经过放疗和(或)化疗；②经过病理学确诊为肺小细胞癌；③临床资料完整；④组织标本经石蜡包埋切片HE染色评估确定肿瘤细胞含量>50%；⑤标本取材过程中RNA完整评分>6.0；⑥签署知情同意书及获得医院伦理委员会批准。排除标准：①无明确病理诊断；②没有完整的随访资料；③预计生存期<6个月；④合并心、肝、肾和造血系统疾病；⑤妊娠期和精神疾病患者。

1.2 试剂及仪器 E- cadherin兔、β- catenin鼠抗人单克隆抗体、Vimentin鼠抗人单克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)；RT- PCR试剂剂盒和脂质体转染试剂盒(Gibco公司)、二氨基联苯胺(DAB，北京华越洋生物科技有限公司)；磷酸盐缓冲液(PBS Thermo Fisher Scientific)；二甲苯(河南八方化工原料销售有限公司)；无水乙醇(苏州市晶协高新电子材料有限公司)；切片石蜡(廊坊乾冈塑料制品有限公司)。脱水机(泰州海鸥洗涤机械有限公司)；包埋机(湖北泰康医疗设备有限公司)；切片机(无锡双盛石化装备有限公司)；切片漂烘温控箱(中科美其北京科技有限公司)；全自动高压锅(日本SANYO公司)。

1.3 组织芯片制作与免疫组化染色 将81例患者癌组织和癌旁组织标本的HE切片，按照对应顺序做好记号，将切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化，以自来水冲洗1 min，清除内源性过氧化物酶，置于高压锅内高温高压修复抗原。滴加稀释后的一抗，在37℃室温下放置2～3 h，以PBS清洗，清洗后滴加二抗，37℃室温下放置20 min后以PBS清洗。每张芯片加入100 μl的DAB显色，用苏木素复染，经过梯度乙醇脱水、中性树胶封片后镜检。依据EnVision试剂盒说明书按照免疫组织化学染色步骤进行。

1.4 免疫组化结果判断 染色强度：细胞中无着色计为1分，淡棕色为2分，棕黄色为3分，深棕色为4分；阳性细胞比例评分：阳性细胞计数≤10%计1分，11%～25%计2分，26%～50%计3分，≥51%计4分。将染色强度和阳性细胞比例积分相乘，≤2分者为阴性，>2分者为阳性。

1.5 随访 出院患者以电话或门诊方式随访。随访5～36个月。中位随访时间为24个月。

1.6 统计学方法 采用SPSS17.0软件进行t检验，χ2检验，Log- rank检验，Cox回归模型分析。

2 结 果

2.1 EMT相关蛋白在癌旁组织和癌组织中的表达 E- cadherin与β- catenin蛋白阳性表达在细胞膜，Vimentin蛋白阳性表达在细胞质。肺癌组织标本中E- cadherin和β- catenin阳性表达为40例(49.38%)和12例(14.81%)，较癌旁组织表达明显减少〔59例(72.84%)，42例(51.85%)，χ2=9.377,P=0.002;χ2=25.000,P=0.000〕；Vimentin在癌组织和癌旁组织中阳性表达分别为45例(55.56%)、19例(23.46%)，癌组织中阳性表达多于癌旁组织(χ2=12.393,P=0.000)。见图1。

2.2 EMT相关蛋白在癌旁组织中表达与患者预后的关系 81例患者平均生存时间为24个月。根据Kaplan- Meier生存分析结果显示：在癌旁组织中E- cadherin阳性、β- catenin阳性和Vimentin阴性患者预后较E- cadherin阴性、β- catenin阴性和Vimentin阳性患者预后好(P=0.000、P=0.001和P=0.041)。见图2。

2.3 预后影响因素分析 以癌旁组织中E- cadherin、β- catenin和Vimentin复合体的表达进行分类，EMT- L1为1～2种表达异常，EMT- L2为3种表达异常。按照患者的年龄、性别、肿瘤直径、临床分期、肿瘤分化程度和EMT蛋白表达进行Cox回归多元素分析。结果显示：临床分期、肿瘤分期、EMT- L和肿瘤分化程度是独立的风险预后因子，见表1。

图1 EMT相关蛋白在癌旁组织及癌组织中的表达(DAB，×400)

图2 E- cadherin、β- catenin及Vimentin表达差异患者的生存情况对比

病理学因素βSEWaldχ2值P值Exp(B)95.0%CI临床分期0.7750.2757.9410.0052.1701.266～3.720肿瘤分期0.7430.2807.0330.0082.1021.214～3.639EMT-L1.5670.5258.9180.0034.7931.714～13.405肿瘤分化程度0.9300.4075.2340.0222.5351.143～5.623

3 讨 论

EMT是由上皮表型向间质表型转化的现象，以E- cadherin下降和Vimentin上升为生物学特征〔7〕。EMT发生与肿瘤细胞侵袭、转移能力相关〔8〕，是细胞发生侵袭转移的重要内在机制〔9～11〕。癌旁组织是指距离癌症病灶2 cm的周围组织，其组织在显微镜下细胞类型及形态呈现正常状态。但目前关于癌旁组织的定义并不明确，多数癌组织周围1～2 cm为癌组织定于较广，但食道癌和头颈癌中，癌症组织外7 cm处也可检测到分子水平的异常，因此在检测癌组织中相关指标的检测同时，对癌旁组织的检测也同样具有重要的意义。目前关于EMT研究都是针对癌细胞较多，晚期肿瘤的进展及预后相关研究也有了一定的发展，而关于癌症早期阶段及癌旁组织未发生明显组织形态学异常时，EMT相关蛋白的表达的差异及意义并未出现相关研究。本研究显示肺癌组织标本中E- cadherin、β- catenin阳性表达率低于癌旁组织，而Vimentin在癌组织中表达多于癌旁组织。且与相关研究〔12〕相似，EMT相关蛋白E- cadherin、β- catenin和Vimentin在癌旁组织中的异常表达对患者的预后也有重要的影响，临床分期、肿瘤分期、EMT- L和肿瘤分化程度是独立的风险预后因子。由此可见，临床上针对肺癌患者的预后在注意临床分期、肿瘤分期和分化程度外，癌旁组织中的EMT相关蛋白表达异常也值得引起重视。但由于本次研究存在样本量较少、随访期较短的不足，且相关学者〔13〕认为肿瘤的预后与遗传学和肿瘤微环境相关，主张EMT并非肿瘤发生远处转移的过程之一，因此具体的作用机制及预后价值还需进行大量的研究论证。

1 赫 捷，赵 平，陈万青.2011中国肿瘤登记年报〔M〕.北京：军事医学科学出版社，2012：62.

2 李翔宇，肖 敏，郭小龙，等.DHA预防及辅助治疗癌症功能概述〔J〕.食品安全导刊，2014；(19)：68- 9.

3 鲍俊屹，白亚娜，尚 慧，等.某职业队列人群中老年肺癌患者分布特征10年变化趋势〔J〕.中国老年学杂志，2014；34(21)：6166- 8.

4 Aberle DR，Adams AM，Berg CD，etal.National lung screening trial research team〔J〕.N Engl J Med，2011；365(5)：395- 409.

5 盛 旺，吕晓君，安汉祥，等.肺癌组织中水通道蛋白的表达及其与上皮- 间质转化的相关性〔J〕.中国老年学杂志，2015；35(2)：362- 3.

6 Hui L，Zhang S，Dong X，etal.Prognostic significance of twist and N- cadherin expression in NSCLC〔J〕.PLoS One，2013；8(4)：e62171.

7 Thiery JP，Acloque H，Huang RY，etal.Epithelial- mesenchymal transitions in development and disease〔J〕.Cell，2009；139(5)：871- 90.

8 曹勤琛，赵路军，王 平，等.非小细胞肺癌中EMT的发生机制及预后价值的研究进展〔J〕.中国肺癌杂志，2014；17(7)：569- 74.

9 Thomson S，Petti F，Sujka- Kwok I，etal.A systems view of epithelial- mesenchymal transition signaling states〔J〕.Clin Exp Metastasis，2011；28(2)：137- 55.

10 Miealizzi DS，Farabaugh SM，Ford HL.Epithelial- mesenchymal transition in cancer：parallels between normal development and tumor progression〔J〕.J Mammary Gland Biol Neoplasia，2010；15(2)：117- 34.

11 Aeloque H，Adams MS，Fishwick K，etal.Epithelial- mesenchymal transitions：the importance of changing cell state in development and disease〔J〕.J Clin Invest，2009；119(6)：1438- 49.

12 陈清勇，严 杰，胡慧珍，等.埃兹蛋白的表达与非小细胞肺癌转移和预后的关系〔J〕.中华肿瘤杂志，2012；34(6)：436- 40.

13 Chui MH.Insights into cancer metastasis from a clinicopathologic perspective：epithelial- mesenchymal transition is not a necessary step〔J〕.Int J Cancer，2013;132(7)：1487- 95.

〔2016- 05- 08修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

2014年海南省自然科学基金项目(No.814387)

梁 冬(1973- )，女，主任医师，博士后，硕士生导师，主要从事呼吸内科及肺癌临床研究。

卓 越(1979- )，男，主治医师，主要从事肺癌的临床研究。

R73

A

1005- 9202(2017)15- 3685- 03；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.018