加替沙星胶联羊膜药膜治疗细菌感染性角膜炎模型兔的疗效

刘燕霞 赵 敏

(重庆医科大学附属第一医院，重庆 400050)

加替沙星胶联羊膜药膜治疗细菌感染性角膜炎模型兔的疗效

刘燕霞 赵 敏

(重庆医科大学附属第一医院，重庆 400050)

目的 探讨加替沙星胶联羊膜药膜治疗细菌性角膜炎兔模型的效果。方法 参照常规方法制作加替沙星胶联羊膜药膜。新西兰大白兔25只中随机取5只，左眼为对照眼，右为实验眼。待动物完全麻醉后，将制成的药膜片覆盖于眼球表面后揭去表层的硝酸滤纸，并用尼龙缝线间断缝合固定于角膜缘浅层巩膜。对照眼结膜囊内滴入配制的3 mg/ml加替沙星溶液50 μl，并于12 h后重复滴眼一次。分别于术后和首次滴眼后1 d、2 d、3 d、4 d、5 d双眼同时抽取房水。利用高效液相色谱法检测实验眼和对照眼房水中加替沙星浓度。制作金葡球菌性角膜溃疡动物模型，将溃疡形成后的动物分为4组，每组4只，分别为A组：生理盐水组，B组：加替沙星滴眼液组，C组：加替沙星胶联羊膜药膜组，D组：单层羊膜组。取各组溃疡愈合的兔眼作细菌培养，检查各组金葡球菌性角膜溃疡的细菌阴转情况。取溃疡组织石蜡包埋、切片，HE染色。同时对各组角膜溃疡动物的疗效进行判定。 结果 实验眼各时间点房水中均可测出加替沙星，浓度0.036～0.274 μg/ml，实验组第1、2、3天房水中加替沙星浓度与第4、5天相比明显较高；对照眼仅在第1天和第2天检测出加替沙星，且浓度显著低于实验眼(P<0.05)。角膜溃疡，加替沙星滴眼液和药膜均疗效显著，且药膜在干预3 d和7 d后评分均显著低于加替沙星滴眼液干预(P<0.05)；加替沙星滴眼液和药膜在干预后细菌培养情况均出现一定程度的阴转，而另外两组仅生理盐水干预7 d后出现1例阴转。角膜切片HE染色观察加替沙星滴眼液和药膜干预角膜上皮及基质有轻微水肿，炎症细胞浸润大量减少；加替沙星滴眼液和药膜均疗效显著，痊愈率及好转率分别为(75.00% vs 87.50%)和(100.00% vs 100.00%)。结论 加替沙星胶联羊膜药膜对金葡球菌性角膜溃疡具有良好的治疗作用，开辟了治疗细菌性角膜溃疡的另一途径。

加替沙星胶联羊膜药膜；细菌性角膜炎

细菌性角膜炎是世界性的常见致盲眼病，多因细菌感染而致角膜上皮缺损及相关基质坏死，严重损害视力〔1〕。目前在临床上多以抗生素为主进行局部的抗感染治疗。感染角膜的细菌对某种抗生素敏感，但该种抗生素可能会因其渗透力弱或在局部保留时间较短等原因，仅有少量的药物透过角膜发挥药效，其他大部分在结膜被吸收或流入鼻腔，难以达到较好的治疗效果〔2〕。羊膜可促进上皮形成，抑制炎症、减少新生血管形成，抑制纤维化〔3～5〕。纤维蛋白胶是近年来广泛应用于临床手术过程中发挥止血、封闭局部组织的生物制剂，具有生物相容性、可吸收性、无毒性等特点。我室在已有的实验基础上，将加替沙星与纤维蛋白胶混合，并研究了加替沙星纤维蛋白胶的体外缓释作用及持续抑菌作用，将加替沙星纤维蛋白胶与羊膜胶联，制成一种新型复合生物学材料——加替沙星胶联羊膜药膜(GFBAM)。本文拟对GFBAM在体内的缓释作用进行初步的实验研究。

1 材料与方法

1.1 一般资料 加替沙星、纤维蛋白胶、1%荧光素钠溶液(与注射用水以1∶3的比例稀释成0.25%浓度，避光保存待用)。新西兰大白兔25只，雌雄不分，体重2～2.5 kg，无眼疾，均由本校动物实验中心提供。动物手术显微镜：上海医用光学仪器厂，眼科显微器械：苏州医疗器械厂，羊膜压贴器：自制。

1.2 方法

1.2.1 GFBAM的制备 羊膜的制备参照Grueterich 等〔6〕方法。加替沙星胶联羊膜的制备方法：精密称取15 mg加替沙星，溶于2.5 ml纤维蛋白胶催化液中，并与2.5 ml纤维蛋白胶主体液分别注入混合注射器中备用。取贴载于硝酸纤维素滤纸甘油保存后的羊膜片，0.9%生理盐水充分复水30 min，平整铺放于超净台上，纱布轻拭去表面水分，喷涂枪将加替沙星纤维蛋白胶均匀喷涂于羊膜上，用自制羊膜压贴器轻压于表面2～3 min，确保加替沙星纤维蛋白胶与羊膜黏合紧密，制成GFBAM。大体观察药膜的直径为20 mm，厚度0.1～0.3 mm，加替沙星纤维蛋白胶浓度为3 mg/ml。

1.2.2 加替沙星胶联羊膜移植后兔房水药物浓度测定 从25只新西兰大白兔中随机取5只进行实验，左眼为对照眼(n=5)，右眼为实验眼(n=5)。用速眠新Ⅱ(长春军事医学科学院军事兽医研究所)肌肉注射，0.15 ml/kg全麻动物，盐酸奥布卡因滴眼液(参天制药)实验眼表面麻醉。术中如有必要速眠新Ⅱ可以再次给药，给药剂量为首次减半。待动物完全麻醉后，常规消毒铺巾，开睑，剪除第三眼睑。将方法1.2.1制成的药膜片覆盖于眼球表面后揭去表层的硝酸滤纸，并用8/0的尼龙缝线8针间断缝合固定于角膜缘浅层巩膜。手术结束同时，对照眼结膜囊内滴入3 mg/ml加替沙星溶液50 μl，并于12 h后重复滴眼一次。分别于术后和首次滴眼后1 d、2 d、3 d、4 d、5 d双眼同时抽取房水。取样时，采用速眠新Ⅱ肌肉注射(剂量同前)，全麻动物，取下实验眼的药膜，盐酸奥布卡因滴眼液双眼表面麻醉，于角膜缘内9点位抽取房水0.2 ml，各组每个时间点取5只眼，所有样品注明标号置于-20℃冰箱中冷冻保存，待测。参考丁文婷〔7〕测定房水中加替沙星的高效液相色谱法(HPLC)，检测实验眼和对照眼房水中加替沙星浓度。

1.2.3 金黄色葡萄球菌(金葡球菌)液的制备〔8〕实验前2 d将4℃冰箱保存的金葡球菌接种在琼脂平板上，置于37℃常规培养24 h，取一环细菌接种于2 ml肉汤培养基内37℃ 8 h，再吸取1 ml菌液传代于50 ml肉汤培养基内37℃16 h，用无菌生理盐水将细菌菌液稀释成3×109个/ml浓度，保存于EP管中备用。

1.2.4 金葡球菌性角膜溃疡模型制备及分组 参考1.2.2所用的麻醉方法麻醉后，用微量注射器定量将5 μl金葡球菌液注射兔的角膜中央基质中。接种9 h后，将溃疡形成且炎症发展一致的兔分为4组，每组各4只，8只眼。A组：生理盐水组，B组：加替沙星滴眼液组，C组：GFBAM组，D组：单层羊膜组。A组：予以生理盐水滴眼，qid，每次4滴；B组：予以3 mg/ml加替沙星滴眼液滴眼，qid，每次4滴。C组：行药膜移植术，药膜的制备按照“1.2.1”操作，在制备药膜时加入3 d量的加替沙星，由于加替沙星纤维蛋白胶和药膜中药物的释放以1～3 d更显著，所以每3 d更换一次药膜。D组：在整个角膜表面覆盖一单层羊膜并缝合固定于角膜缘浅层巩膜。定时在干预1、3、7 d后在大体和裂隙灯下观察角膜溃疡情况，并参考相关文献〔9,10〕溃疡评分标准进行相应的症状评分。

1.2.5 细菌培养 在干预前及干预1、3、7 d后，速眠新Ⅱ全麻后，用无菌棉签蘸取生理盐水后涂擦各组溃疡兔眼角膜处，将涂擦的无菌棉签的棉絮放入无菌试管中，盖上软塞，作细菌培养，定性判断各组金葡球菌性角膜溃疡的细菌阴转情况。

1.2.6 组织病理学检查 取各组溃疡干预7 d后的角膜各一只，10%甲醛固定，石蜡包埋、切片，HE染色。

1.2.7 疗效判定 痊愈：溃疡愈合，形成白斑，其余角膜透明，无新生血管，细菌培养阴性，组织病理学检查溃疡面角膜上皮形成，实质层无或有个别中性白细胞浸润。好转：溃疡愈合，形成灰白色混浊斑，其余角膜较混浊，有新生血管形成，细菌培养阳性，组织病理学检查溃疡面虽然形成角膜上皮，但不甚平整，实质层有中性白细胞浸润。无效：角膜穿孔。

1.3 统计学处理 使用SPSS13.0软件对各项资料进行统计分析，组间比较采用t或χ2检验。

2 结 果

2.1 加替沙星胶联羊膜移植后兔房水药物浓度测定结果 实验眼各时间点房水中均可测出加替沙星，浓度0.036～0.274 μg/ml，实验眼第1、2、3天房水中加替沙星浓度与第4、5天相比明显较高(P<0.05)，说明药膜在前3 d释放较多。实验眼在第1、2天房水中加替沙星浓度均显著高于对照眼(P<0.05)，且对照眼在第3、4、5天的房水中已检测不到加替沙星药物浓度。见表1。

2.2 不同干预对模型动物角膜溃疡的治疗效果 A组和D组干预后，角膜溃疡的症状评分均呈一定的增长，且D组症状评分均比A组高，可能与羊膜移植后眼睑粘连严重而使脓液大量增加有关。而B组和C组经干预后症状评分均明显下降(P<0.05)，且C组干预3 d和7 d后评分均显著低于B组(P<0.05)。见表2。

2.3 四组分别干预后兔眼分泌物细菌培养阴转率比较 B组和C组，细菌培养均出现一定程度的阴转，阴转率除B组干预1 d外，其他均显著高于A组(P<0.05)；且C组的细菌培养阴转率高于B组，但差异无统计学意义(P>0.05)。A组和D组干预后仅A组在生理盐水干预7 d后出现1例阴转，推测可能与角膜溃疡自行修复愈合有关。见表3。

表1 加替沙星胶联羊膜移植后房水药物浓度

与对照眼比较：1)P<0.05

表2 不同干预对模型动物角膜症状评分的影响分)

与干预前比较:1)P<0.05；与A组干预后比较:2)P<0.05；与B组干预后比较:3)P<0.05

表3 四组干预后兔眼分泌物细菌培养阴转率比较〔n(%)，n=8〕

与A组干预后比较:1)P<0.05

2.4 病理学检查 A组兔眼角膜上皮及基质层肿胀，特别是基质的右上部位深度结构紊乱，可能由此部位乃注射部位所致，且大量炎症细胞浸润，角膜上皮缺损。B组和C组的角膜上皮及基质有轻微水肿，炎症细胞浸润减少，基质较完整。D组角膜上皮及基质层肿胀，整体深度结构均较为紊乱，大量炎症细胞浸润，角膜上皮缺损。见图1。

2.5 四组分别干预后兔细菌性角膜溃疡的疗效评价 B组、C组痊愈率及好转率差异无统计学意义(P>0.05)，但均要显著高于A组(P<0.05)，主要表现为角膜溃疡愈合，脓性分泌物消失，混合充血减轻，角膜水肿消退，溃疡形成角膜白斑，其余角膜透明。A组有1例痊愈，可能是因为金葡球菌致病力弱，所以角膜溃疡可以自行修复。D组在3 d时发现有大量脓液在羊膜下流动，而7 d时脓性分泌物明显吸收减少，羊膜溶解脱落，角膜与A组相比更混浊，光滑透明度更差，故痊愈率和好转率均低于A组。见表4。

图1 兔角膜组织病理学切片检查

组别痊愈好转无效痊愈率(%)好转率(%)A组1(12.50)3(37.50)4(50.00)12.5050.00B组6(75.00)2(25.00)0(0.00)75.001)100.001)C组7(87.50)1(12.50)0(0.00)87.501)100.001)D组0(0.00)2(25.00)6(75.00)0.0025.00

与A组干预后比较:1)P<0.05

3 讨 论

细菌性角膜炎主要的致病细菌为革兰阳性球菌和革兰阴性杆菌。革兰阳性球菌中的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)占较大比例〔11，12〕，革兰阴性杆菌中的铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa，P)和莫拉菌(moraxella，M)简称为SSPM感染。据日本横滨大学近年来对120例细菌性角膜炎的统计，SSPM感染占72.5%(87例)，上述4种致病细菌分别为15%(18例)、11.7%(14例)、35.8%(43例)、10%(12例)；美国、加拿大也有同样的统计结果。这种倾向不仅出现在工业发达国家，发展中国家也是如此。菲律宾最近对1 762例的统计，SSPM感染占92.2%(1 624例)，分别为4.7%(83例)、42.31%(745例)、26.6%(468例)及18.6%(328例)〔4,5〕。

体外生物力学性能实验证明胶联羊膜比单层羊膜具有更优越的弹性性能、柔韧性和可塑性，有足够的强度以承受缝合力和眼表面张力，也有一定的弹性能够弯曲和随眼球运动时扩张而不压迫眼球。动物体内实验证明在深层角膜损伤和碱烧伤治疗上，胶联羊膜与单层羊膜相比，可以在创面保持更长时间以达到促进组织损伤修复的作用，因而用于眼表移植更具有优越性。纤维蛋白胶是一种具有三维结构的纤维蛋白多聚体，其形成的网架状结构类似一块海绵，其中的网眼形成储药库，随着凝胶的纤溶和吸收，药物缓慢释放。由于纤维蛋白胶在体内具有相对稳定性，一般在1～2 w内逐渐被机体降解吸收。这样，纤维蛋白胶就起到暂时贮存和缓释药物的作用，能提高局部药物浓度，延长药物在局部的滞留时间〔13〕。有实验研究证明，加替沙星对各种革兰阳性菌和革兰阴性菌均具有较强的活性，且与头孢唑林和妥布霉素联合用药相比针对溃疡的愈合率更佳〔14,15〕，是目前治疗角膜细菌感染的有效药物之一。本研究主要对GFBAM进行了制备及部分临床前的研究，主要结论如下：(1)将加替沙星与纤维蛋白胶混合后，与羊膜进行胶联，可制成一种生物制品——GFBAM。(2)HPLC法显示，随着纤维蛋白胶的溶解，加替沙星纤维蛋白胶在体外具有缓释作用。(3)体外抑菌试验显示加替沙星纤维蛋白胶具有持续抑菌作用，随着时间的延长，抑菌作用缓慢减弱。(4)GFBAM移植到眼表后，在房水中可检测出加替沙星浓度，说明该药膜中的药物能缓慢释放并渗透到眼内。(5)GFBAM可以作为一种眼表移植物和组织创伤修复的良好材料，为治疗细菌性角膜溃疡提供了另一有效途径。

1 王 军.细菌性角膜炎药物治疗研究进展〔J〕.现代中西医结合杂志,2015;24(18):2049- 52.

2 吕红玲，武 珅，晏世刚，等.水凝胶角膜给药载体治疗大鼠角膜炎的实验观察〔J〕.广东药学院学报,2013;29(4):407- 11.

3 Schwab IR,Reyes M,Isseroff RR.Successful transplantation of bioengineered tissue replacements in patients with ocular surface disease〔J〕.Cornea,2000;19(4):421- 6.

4 Kobayashi N,Kabuyama Y,Sasaki S,etal.Suppression of corneal neovascularization by culture supernatant of human amniotic cells〔J〕.Cornea,2002;21(1):62- 7.

5 Shimazaki J,Yang HY,Tsubota K.Amniotic membrane transplantation for ocular surface reconstruction in patients with chemical and thermal burns〔J〕.Ophthalmology,1997;104(12):2068- 76.

6 Grueterich M,Espana E,Tseng SC.Connexin 43 expression and proliferation of human limbal epithelium on intact and demuded amniotic membrane〔J〕.IOVS,2002;43(1):63- 71.

7 丁文婷.人眼滴用0.3%加替沙星眼用凝胶、0.3%加替沙星滴眼液和0.5%左氧氟沙星滴眼液的前房穿透性研究〔D〕.杭州：浙江大学，2012.

8 缪明星，陆 琰.阿奇霉素滴眼液对兔眼金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌性角膜炎的治疗作用〔J〕.中南药学,2013;11(7):510- 3.

9 董贤慧，钱 涛，高维娟，等.兔眼真菌性角膜炎模型的病理学观察〔J〕.中国老年学杂志,2012;32(12):2527- 30.

10 安丰田，石 杰，王兰英，等.两种喹诺酮类滴眼液治疗细菌性角膜炎的动物实验与临床试验观察〔J〕.中国药师,2013;16(11):1696- 9.

11 黄 旭，吴国栋，汤宪辉.细菌性角膜炎的病原菌分布与耐药性分析〔J〕.中华医院感染学杂志,2015;25(14):3184- 5.

12 孙静芬，周正申.重症细菌性角膜炎危险因素和致病菌分析〔J〕.上海交通大学学报(医学版),2016;36(6):880- 3.

13 王 帅,曹 斌,张守平.局部应用生物蛋白胶和加替沙星对手及前臂屈肌腱粘连及感染的预防〔J〕.青岛医药卫生，2007;39(2)：82- 3.

14 Afzal Junejo S,Ali Lodhi A,Ahmed M,etal.Efficacy of gatifloxacin in acute bacterial corneal ulcer〔J〕.Pak J Med Sci,2013;29(6):1375- 80.

15 Sharma N,Arora T,Jain V,etal.Gatifloxacin 0.3% versus fortified tobramycin- cefazolin in treating nonperforated bacterial corneal ulcers:randomized,controlled trial〔J〕.Cornea,2016;35(1):56- 61.

〔2016- 05- 17修回〕

(编辑 徐 杰)

重庆市卫生局科研资助项目(渝卫科教2008- 2- 114)

赵 敏(1956- )，男，主任医师，硕士生导师，主要从事角膜及眼表疾病研究。

刘燕霞(1981- )，女，在读硕士，主要从事胶联羊膜治疗角膜及眼表疾病研究。

R772.21

A

1005- 9202(2017)15- 3650- 04；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.005