滋肾育胎丸对肾阳虚型多囊卵巢综合征模型小鼠血清抑制素B及干细胞因子的影响*

邢 佳 傅 萍# 陈婷婷

1 浙江省杭州市中医院 浙江 杭州 310007 2 浙江中医药大学第三临床医学院 浙江 杭州 310053

滋肾育胎丸对肾阳虚型多囊卵巢综合征模型小鼠血清抑制素B及干细胞因子的影响*

邢 佳1傅 萍1#陈婷婷2

1 浙江省杭州市中医院 浙江 杭州 310007 2 浙江中医药大学第三临床医学院 浙江 杭州 310053

滋肾育胎丸 肾阳虚型 多囊卵巢综合征 抑制素B 干细胞因子

多囊卵巢综合征（PCOS）是妇科常见的一种生殖功能障碍和代谢紊乱性疾病，其关键病理机制为卵泡发育异常和排卵障碍。近年来研究发现[1-2]，抑制素B（INHB）、干细胞因子（SCF）与卵泡发育及排卵密切相关。本实验以INHB、SCF为切入点，用cAMP/cGMP比值衡量小鼠模型的阴阳偏向，通过观察滋肾育胎丸对肾阳虚型PCOS模型小鼠血清中INHB、SCF表达的影响，探讨滋肾育胎丸的治疗机制，为临床运用中医药诊治肾阳虚型PCOS提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物：21日龄雌性ICR小鼠，54只，SPF级；浙江中医药大学动物实验中心提供。将小鼠置于浙江中医药大学动物实验中心内饲喂。实验期间同一室内笼养，室温18～22℃，12h光照，12h黑暗，自由饮水，饲料由浙江中医药大学动物实验中心提供。

1.2 药物与试剂：滋肾育胎丸（60g装），购自广州白云山中一药业有限公司；达英-35，由Schering GmbH& Co.Produktions KG提供，每粒含2mg醋酸环丙孕酮和0.035mg炔雌醇，使用时加蒸馏水制成0.3mg/kg混悬液；脱氢表雄酮（DHEA）粉剂，购自美国sigma公司；注射用大豆油（用于溶解DHEA），购自九三集团海尔滨众和商贸有限公司；氢化可的松注射液，购自天津金耀药业有限公司；所有小鼠El isa试剂盒均由杭州昊鑫生物科技股份有限公司提供。

1.3 分组与饲养：适应性喂养2日后，将21日龄雌性ICR小鼠随机分为6组，分别设空白组、模型组、滋肾育胎丸低剂量组、滋肾育胎丸中剂量组、滋肾育胎丸高剂量组、达英-35组，每组各9只，全程喂以普通饲料。

1.4 方法：分述如下。

1.4.1 动物模型的建立：采用脱氢表雄酮联合氢化可的松法诱导肾阳虚型PCOS小鼠模型。模型组、滋肾育胎丸低剂量组、滋肾育胎丸中剂量组、滋肾育胎丸高剂量组、达英-35组每日予颈背部皮下注射9mg/100g DHEA油溶液0.1ml，26日后，加用氢化可的松25mg/kg体重后肢肌肉注射，日1次，连续14日；空白组每日予颈背部皮下注射注射用大豆油0.1ml，26日后，加用等体积生理盐水后肢肌肉注射，日1次，连续14日。

1.4.2 预防性治疗：滋肾育胎丸低、中、高剂量组全程分别予滋肾育胎丸1.13g/kg、4.50g/kg、2.25g/kg灌胃，共40天；达英-35组全程予达英-35蒸馏水混悬液0.3mg/kg灌胃，共40天；空白组、模型组予等体积生理盐水灌胃。

1.4.3 标本采集：末次给药后12小时，对小鼠行颈椎脱臼法处死并采集标本。

1.5 观察指标：①实验开始后每3天观察一次小鼠一般状态（活动度、被毛颜色及光泽度等）；②从28日龄起小鼠阴门开放后每日行阴道涂片观察脱落细胞改变直到实验结束；③酶联免疫吸附法（El isa）测定血清黄体生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、睾酮（T）、雌二醇（E2）、环磷酸腺苷（cAMP）、环磷酸鸟苷（cGMP）、抑制素B（INHB）、干细胞因子（SCF）水平。④对所取卵巢进行病理切片，在光学显微镜下观察其组织形态学改变。

1.6 统计学方法：采用IBM SPSS Statistics 19.0软件对测定数据进行统计分析。全部计量资料以均数±标准差（±s）表示，进行方差分析或t检验。两组计量资料间比较采用t检验；多组间比较采用方差分析，首先行方差齐性检验，若方差齐性，则选用LSD或SNK法，若方差不齐，则选用Tamhane’s T2或Dunnet t's T3法。双侧检验，以P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠一般状态的变化：空白组小鼠喜动活跃，动作敏捷，大便正常，毛色光泽，肢尾温暖，睡眠时间正常。模型组小鼠精神萎靡，反应迟钝，大便稀溏，群聚蜷缩，活动减少，毛色黯淡，肢尾冷，睡眠时间延长。各治疗组小鼠造模成功后表现出与模型组相似的阳虚症状，随着用药时间的延长，部分小鼠精神状态较前好转，活动增加，被毛光泽恢复，大便成形。

2.2 各组小鼠阴道脱落细胞的变化：空白组小鼠以4-5天为1个正常动情周期，呈现动情前期、动情期、动情间期、动情后期4个时期规律出现。模型组小鼠脱落细胞持续角化，完全失去正常动情周期。各治疗组小鼠在观察初期脱落细胞主要表现为无核角化细胞和少量上皮细胞，失去正常动情周期，随着用药时间的延长，部分小鼠动情周期逐渐恢复正常。

2.3 各组小鼠血清性激素水平、cAMP/cGMP比值的改变：见表1、表2。

表1 各组小鼠血清性激素水平的变化（±s，n=9）

表1 各组小鼠血清性激素水平的变化（±s，n=9）

注：与空白组比较，★P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05。

分组空白组模型组低剂量组中剂量组高剂量组达英-35组LH（ng/L）1412.99± 23.19 1787.09±102.44★1656.85± 38.02 1512.19± 12.38 1467.46± 29.48▲1461.33± 27.13▲T（nmol/L）134.62±1.84 147.22±3.06★144.91±4.02 138.25±2.34 136.16±2.61▲137.64±1.78▲E2（ng/L）49.07±0.50 34.52±3.89★38.60±0.94 41.33±3.32 45.70±1.40▲44.75±1.33▲FSH(IU/L) 8.08±0.24 7.38±0.16★7.45±0.10 7.56±0.11 7.97±0.07▲7.74±0.15▲LH/FSH 5.25±0.16 7.27±0.36★6.67±0.17 6.00±0.12 5.53±0.14▲5.67±0.20▲

表2 各组小鼠血清cAMP、cGMP、cAMP/cGMP比值的变化（±s，nmol/L，n=9）

表2 各组小鼠血清cAMP、cGMP、cAMP/cGMP比值的变化（±s，nmol/L，n=9）

注：与空白组比较，★P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05。

组别空白组模型组低剂量组中剂量组高剂量组达英-35组cAMP 8.41±0.37 7.06±0.58★7.43±0.29 7.58±0.43 7.92±0.24 7.77±0.23 cAMP/cGMP 1.80±0.14 1.28±0.13★1.38±0.11 1.46±0.10▲1.61±0.84▲1.54±0.77▲cGMP 4.67±0.21 5.54±0.23★5.40±0.38 5.20±0.16 4.93±0.20 5.07±0.18

2.4 滋肾育胎丸对小鼠血清INHB、SCF的影响：见表3。

表3 滋肾育胎丸对小鼠血清INHB、SCF的影响（±s）

表3 滋肾育胎丸对小鼠血清INHB、SCF的影响（±s）

注：与空白组比较，★P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05。

SCF（ng/L）104.89±7.68 63.95±8.20★77.48±6.05 84.87±7.72▲91.45±9.92▲89.51±7.89▲例数组别空白组模型组低剂量组中剂量组高剂量组达英-35组9 9 9 9 9 9 INHB（ng/L）16.18± 6.62 29.08± 8.41★26.00±12.59 24.93± 8.22 18.27± 8.12▲28.30± 9.98

2.5 各组小鼠卵巢组织形态学的改变：空白组（A、B）卵巢内存在各级卵泡，颗粒细胞层致密、排列整齐，膜细胞层薄，间质细胞致密、排列整齐，白膜薄，表面光整。模型组（C、D）小鼠卵巢内囊性扩张的卵泡增多，卵泡腔显著扩张，卵泡内卵母细胞及放射冠消失，颗粒细胞层变薄且排列疏松，膜细胞不规则增生、排列欠整齐，卵巢间质细胞排列紊乱，白膜增厚、表面欠光整。滋肾育胎丸低剂量组（E、F）、滋肾育胎丸中剂量组（G、H）部分小鼠卵巢病理切片显示颗粒细胞层数较模型组略增多，卵泡膜细胞层较模型组略变薄。滋肾育胎丸高剂量组（I、J）和达英-35组（K、L）颗粒细胞层数较模型组明显增多，形态规则，排列整齐，白膜和卵泡膜细胞层较模型组变薄。具体见图1、图2。

图1 各组小鼠卵巢组织形态学

图2 各组小鼠卵巢组织形态学

3 讨论

多囊卵巢综合征（PCOS）病理环节的根本在于卵泡发育异常和排卵障碍。阴阳学说[3]认为，cAMP/cGMP比值能全面衡量机体的阴阳偏向。本实验结果显示，模型组小鼠卵巢病理切片符合小鼠PCO样改变，结合小鼠血清性激素变化、cAMP/cGMP比值改变及肾阳虚症状，说明肾阳虚型PCOS小鼠模型建立成功。

现代学者研究[1，2]发现，INHB、SCF为卵巢局部因子，与卵泡的发育及排卵有着密切的关系。INHB是一种糖蛋白，有学者发现[1]血清INHB水平在PCOS患者中表达升高，推测INHB与PCOS的发病有关。Hendrix等研究发现[4]，过量的INHB抑制了垂体FSH的合成与分泌，使卵泡生长受阻并过早闭锁，形成多囊卵巢。本实验中，模型组小鼠血清INHB水平高于空白组、FSH水平低于空白组，差异均有统计学意义（P＜0.05），与以上结论相符。

SCF为多肽类物质，是卵巢局部生长因子之一[5]。有关研究显示[6]，较高水平的SCF有利于卵细胞的受精和优质胚胎的形成。SCF为酪氨酸激酶受体(c-kit)的配体，它与靶细胞上的c-kit受体结合，激活下游信号通路，产生生物学效应，抑制SCF/c-kit信号通路会影响原始卵泡发育、初级卵泡生长及体内成熟卵泡的排出[7]。本实验结果显示，肾阳虚型PCOS小鼠血清SCF水平明显低于空白组（P＜0.05），由此，我们推测SCF的表达水平下降可使SCF/c-kit信号通路的活性下调，进而抑制卵泡发育及成熟卵泡的排出。

滋肾育胎丸是全国著名中医妇科专家、广州中医药大学罗元恺教授的经验方，临床上可用于多囊卵巢综合征的治疗。滋肾育胎丸由菟丝子、熟地黄、人参、杜仲、首乌、枸杞子、阿胶、鹿角霜、巴戟天、桑寄生、续断、党参、白术、艾叶、砂仁组成，以温补肾阳为主，佐以益气养血。方中菟丝子为君药，能补肾益精固胎；人参、党参、白术大补元气；鹿角霜补元阳、生精髓；配以巴戟天、杜仲、续断、桑寄生益肾固冲；首乌、枸杞子、熟地黄、阿胶填补肝肾，滋阴养血；艾叶温经散寒，调经止血；砂仁理气和中。全方肾、肝、脾同治，能良好地促进卵泡发育、诱发排卵。本实验结果表明滋肾育胎丸高剂量组小鼠的卵巢组织形态与空白组基本一致，且高剂量滋肾育胎丸能显著降低肾阳虚型PCOS小鼠血清T、LH/FSH、INHB，升高血清E2、cAMP/cGMP、SCF，并能改善其肾阳虚症状，证明滋肾育胎丸对肾阳虚型PCOS有良好的治疗作用。我们猜测其治疗机制可能是通过降低INHB来解除INHB对FSH的过度抑制，同时增加SCF的表达，上调SCF/c-kit信号通路的活性，从而促进卵泡发育及排卵，纠正其内分泌紊乱状态，最终达到治疗肾阳虚型PCOS的目的。

[1]李莹,杨晓庆,杨晓葵.抗苗勒管激素和抑制素B预测卵巢储备功能的临床研究[J].实用妇产科杂志,2014,30(1)：26-29.

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[3]李耿,张喆,尹西拳，等.地黄丸类方对肾阳虚大鼠HPA轴的影响[J].中药新药与临床药理,2015,26(3)：320-324.

[4]Hendrix AO,Hughes CL,Selgrade JF.Model ing Endocrine Control of the Pituitary-Ovarian Axis:Androgenic Inf luence and Chaotic Dynamics[J].Bul l Math Biol,2014,76：136-156.

[5]陈婷婷,傅萍,邢佳，等.多囊卵巢综合征发病机制的影响因子研究[J].中国优生与遗传杂志,2016(11)：122-125.

[6]李静,崔薇,孙伟，等.电针对多囊卵巢综合征大鼠干细胞因子及肿瘤坏死因子-α表达的调节[J].中国中医药信息杂志,2012(12)：26-28.

[7]陶御风.菟丝子应用发微[J].浙江中医杂志,2003,38 (9)：44.

[8]王冠民，郝现军.药物妙用5则[J].浙江中医杂志,2002, 37(10)：26.

2017-03-31

广东省罗元恺滋肾育胎丸中青年科研基金项目滋肾育胎丸对肾虚型PCOS模型小鼠cAMP/cGMP、AMH、INHB、SCF影响的研究，编号：HX201502-140203；国家中医药管理局傅萍全国名老中医药专家传承工作室建设项目，编号：国中医药人教发〔2014〕20号；浙江省傅萍名老中医专家传承工作室研究项目，编号：GZS2012023

# 通讯作者：傅 萍，E-mai l：fupingss@163.com