围手术期检测肝细胞癌病人外周血AFPmRNA和MAGE-1mRNA的临床意义

赵何伟，顾殿华，周 兵，孙 勇

(南京医科大学附属淮安市第一人民医院 肝胆胰外科，江苏 淮安223300)

围手术期检测肝细胞癌病人外周血AFPmRNA和MAGE-1mRNA的临床意义

赵何伟，顾殿华，周 兵，孙 勇*

(南京医科大学附属淮安市第一人民医院 肝胆胰外科，江苏 淮安223300)

近年来，巢式复合酶聚合酶链反应(RT-PCR)技术被广泛用于实质器官恶性肿瘤微转移及复发的检测[1]。AFP mRNA和MAGE-1 mRNA是肝细胞癌患者常用的检测指标[2]。本文分析这两种mRNA在肝细胞癌诊断方面的临床价值，探讨围手术期联合检测对于监测术后肿瘤复发的意义，现报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料

病例组(A组)：2015年1月-2016年1月期间我院肝胆外科收治的肝细胞癌患者66例，其中男/女：38/28;年龄45-62岁，平均年龄：(51.2+8.8)岁；诊断依据为术中病理；B组：同期收治的肝炎和肝硬化患者48例，其中男/女：19/29;年龄44-64岁，平均年龄：(50.2+8.4)岁；符合《中华医学会第十一届会议》关于病毒性肝炎和肝硬化的诊断标准[3]。排除合并恶性肿瘤的患者；C组：同期收治的肝脏转移瘤31例，有胃肠、乳腺、肺等其他器官恶性肿瘤病史，CT表现为多发性病灶，增强扫描符合“早出晚归”的特点，其中男/女：12/19;年龄43-66岁，平均年龄：(51.1+8.7)岁；D组：肝血管瘤50例，符合《中华医学会第十一届会议》关于肝血管瘤的诊断标准。其中男/女：23/27，年龄41-65岁，平均年龄：(52.1+7.9)岁；E组：健康志愿者40人，其中男/女：15/25，年龄43-67岁，平均年龄：(51.8+8.7)岁；5组患者的性别和年龄之间不存在统计学差异(P<0.05)，具有可比性。参与本次研究的所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 方法

病例组患者于围手术期(术前1天、术后7天、术后28天)抽取肘正中静脉血5 ml，对照组于住院期间或门诊抽取任意时间肘正中静脉血5 ml。通过聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法提取外周血中单核细胞。采用异硫氰酸呱法提取细胞中总RNA。RT-PCR设定的参数为：变性(96℃，30 s)，退火(56℃，60 s)，延伸(68℃，30 s)，循环40轮，所得产物为176 bp和101 bp，产物101 bp在2.0-琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像分析仪照相。表达AFPmRNA和MAGE-1mRNA的细胞株HepG2(北京生物研究院)作为阳性对照。如图1。

M：DNA-Marker 0：含104癌细胞 1：含 103癌细胞 2：含102癌细胞 3：10个癌细胞 4：1个癌细胞 5：无癌细胞

图1 外周血AFPmRNA检测敏感性

1.3 仪器及试剂

RT-PCR Mx3000P由日本SANYO公司提供，RT-PCR检测试剂盒及Taq DNA聚合酶由美国Promega公司提供，PRMI-1460培养基和DNA-Marker由德国Roche生物技术有限公司提供，其余实验用缓冲液、稀释液、分离液均来自北京中山生物科技有限公司。操作过程严格按仪器及试剂说明进行。

1.4 肝细胞癌根治术

66例肝细胞癌患者均行肝细胞癌根治术，根治术标准为全麻下彻底切除肉眼可见的肿瘤，清除癌栓，并完成相应区域淋巴结清扫。单个病灶直径≤2 cm者可在B超引导下通过射频(RF)进行全病灶毁损。整个手术过程中遵循无瘤原则。

1.5 随访

对病例组患者进行为期3个月的随访，肝内肿瘤复发和转移的诊断依据美国肝癌研究协会2006年制定的标准；肝外转移依据临床表现及影像学检查。

1.6 统计学方法

采用SPSS 20.0软件对所有数据进行分析处理，计数资料用率表示，组间对比采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 术前病例组和对照组AFPmRNA、MAGE-1mRNA阳性率比较

术前病例组AFPmRNA和MAGE-1mRNA阳性率分别为58.2%和61.8%，二者均阳性占20.0%。肝转移瘤组AFPmRNA阳性率为35.5%，与病例组差异有统计学意义(P<0.05)。其余各对照组阳性率极低，与病例组的差异有显著的统计学意义(P<0.01)，详见表1。

表1 术前病例组和对照组AFPmRNA、MAGE-1mRNA阳性率比较

2.2 围手术期AFPmRNA、MAGE-1mRNA的检测与术后复发的关系

通过比较，Ⅱ组患者术后肿瘤复发率最高(76.5%)，Ⅲ组复发率最低(9.1%)，三组的差异有统计学意义(P<0.05)，围手术期AFPmRNA和MAGE-1mRNA均阳性的患者比单一阳性的患者复发率高，差异均存在统计学意义(P<0.05)，其中IIb组患者复发率为100%;详见表2。在为期3个月的随访中Ⅱ组死亡人数为3例(17.64%)，Ⅲ组死亡人数为1例(4.54%)，Ⅰ组无死亡患者；总死亡率为6.06%；图2为IIb组中的一个患者通过RT-PCR检测围手术期外周血AFPmRNA的凝胶成像结果。

表2 围手术期AFPmRNA、MAGE-1mRNA的检测与术后复发的关系

注：1与2相比，P=0.018；1与3相比，P=0.024；2与3相比，P=0.000 Ⅰ组：术前术后持续阳性(Ia：AFPmRNA或MAGE-1mRNA阳性；Ib：二者均阳性)；Ⅱ组：术前阳性，术后7天阴性，术后28天阳性(IIa：AFPmRNA或MAGE-1mRNA阳性；IIb：二者均阳性)；Ⅲ组：术前阳性，术后阴性(IIIa：AFPmRNA或MAGE-1mRNA阳性；IIIb：二者均阳性)。

M：DNA-Marker N：阴性对照 P：阳性对照 I：手术前1天(+) 2：术后7天(-) 3：术后28天(+)

图2 肝细胞患者围手术期AFPmRNA检测结果

3 讨论

原发性肝癌作为一种发病率较高的恶性肿瘤，流行病学显示在亚太地区具有较高的发病率[4]。组织学显示肝细胞癌的发病率较隐匿，早期的临床症状一般不明显的表现，这样给早期肝癌发现和诊断造成了较大的难度，在以往的病例研究资料中显示肝癌患者的发现大多数处于中晚期，同时由于肝细胞癌的高侵袭性和高复发性等特点，会造成肝细胞癌的死亡率极高[5]。

AFP(甲胎蛋白)作为一种临床上筛选肝细胞癌变肿瘤术后检测的重要血清学指标在临床上使用广泛,但是极易受到非癌性病变的疾病(慢性乙性肝炎、肝硬化)影响。部分学者指出相对于血清学AFP的蛋白检测，分子RNA检测更为准确可靠[6]。AFP的基因位于人类第4号染色体上，胎儿时期在干细胞和卵黄囊中合成，出生后会随着白蛋白的合成增加而迅速的下降。AFP基因在正常人肝细胞中呈现极低表达状态，在肝癌患者中呈现高表达[7]。MAGE是一类肿瘤特异性的抗原，是位于人类X染色体长臂末端的MAGE基因家族编码，由12个基因成员组成，以往研究中显示MAGE-1基因在原发性肝癌组织中呈现着特异性的高表达状态[8]。本次研究结果中发现原发性肝癌组中的AFPmRNA、MAGE-1mRNA的阳性率要显著的高于健康人群、非癌变的慢性肝病和非肝癌患者(P<0.05)。与宋爱英等研究结果一致[9]。外周血液的AFPmRNA、MAGE-1mRNA不但对于诊断原发性肝癌具有重要特异性，在围术期的复发预测上也具有重要的意义，本次研究中发现在术前术后均阳性的患者随访3个月术后复发率要显著的高于术后阴性的患者(P<0.05)。肝癌患者围术期外周血中的AFPmRNA、MAGE-1mRNA可以对术后的肝癌复发率具有较好的预测和评价[10，11]。

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南京医科大学科技发展基金项目(2016NJMUZD086)

1007-4287(2017)08-1362-03

2017-07-20)

*通讯作者