CD40、HLA-DR在自身免疫性肝病Kupffer细胞的表达变化

李虹霞 ,郭丽萍,张 君,周 璐

(1.天津市泰达医院 消化内科，天津 300457；2.天津医科大学总医院 消化内科)

CD40、HLA-DR在自身免疫性肝病Kupffer细胞的表达变化

李虹霞1,郭丽萍2,张 君2,周 璐2

(1.天津市泰达医院 消化内科，天津 300457；2.天津医科大学总医院 消化内科)

目的 研究自身免疫性肝病Kupffer细胞抗原呈递分子的表达变化。方法 按照自身免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎的诊断标准进行分组，脂肪肝作为对照组。入选患者的肝穿石蜡切片进行CD40、HLA-DR免疫组化染色，随机选取10个显微镜高倍视野(×400倍)，观察染色情况，并统计CD40+、HLA-DR+细胞数目。结果 CD40在自身免疫性肝病组的阳性细胞数低于对照组。CD40免疫组化阳性产物呈棕褐色或棕黄色颗粒状着色，主要位于细胞膜，少部分位于细胞质。分别计算自身免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎和脂肪肝3组肝穿标本中的CD40阳性的kupffer细胞数绝对值，结果显示： 3组间CD40阳性的kupffer细胞的计数绝对值比较具有统计学意义(P=0.04，P<0.05)。AIH与PBC组比较无统计学差异(P=0.428,P>0.05)；AIH与脂肪肝组比较具有统计学意义(P=0.02，P<0.05)。免疫组化中，HLA-DR在自身免疫性肝病组的阳性细胞数低于对照组，HLA-DR免疫组化染色阳性产物呈棕褐色颗粒，主要位于细胞膜。分别统计AIH、PBC和脂肪肝3组的HLA-DR阳性的kupffer细胞计数的绝对值，结果显示3组比较其结果具有统计学意义(P=0.015，P<0.05)，AIH与脂肪肝组比较具有统计学意义(P=0.017，P<0.05)。CD40、HLA-DR结果与肝功能、凝血功能化验检查结果进行相关性分析，结果显示具有相关性。结论 自身免疫性肝病患者组的肝穿石蜡切片免疫组化染色显示CD40及HLA-DR表达较脂肪肝组数量减少，且 CD40、HLA-DR与自身免疫性肝病的转氨酶变化相关，提示自身免疫性肝病可能存在kupffer细胞抗原呈递功能减弱，是导致自身免疫性肝病肝损害的原因之一。

自身免疫性肝病；抗原呈递；肝功能损害

(ChinJLabDiagn,2017,21:1350)

自身免疫性肝病的发病机制目前尚未完全清楚，多数研究认为其发病过程可能为遗传、环境、自身抗原、免疫功能紊乱等多种因素联合作用，最终导致免疫机制损伤，产生肝脏组织的免疫反应，造成肝细胞炎症坏死，并逐步进展为肝纤维化、肝硬化[1]。近期研究提示单核-巨噬细胞功能异常与自身免疫性肝病的发病密切相关。有研究显示证实自身免疫性肝病动物模型的单核-巨噬细胞的吞噬能力降低[2]，并且近期科研数据显示固有免疫是导致自身免疫性肝病肝脏损伤的重要因素，肝脏单核-巨噬细胞功能已成为目前自身免疫性肝病的研究热点[3-5]。CD40、HLA-DR是抗原呈递分子，具有抗原呈递功能，本研究拟讨论CD40、HLA-DR在自身免疫性肝病的表达变化。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2015年1月至6月期间在天津市医科大学总医院消化内科住院并进行肝脏穿刺病理活检的患者共27例，其中自身免疫性肝炎(AIH)患者14例，男3例，女11例，年龄34-68岁，中位年龄为45±2岁；原发性胆汁性胆管炎(PBC)患者7例,男1例，女6例，年龄26-59岁，中位年龄为47±1岁；对照组脂肪肝患者共6例，男3例，女3例，年龄31-64岁，中位年龄为51±3岁。所有入选病例均具有完整的血生化、自身抗体、病毒学等检查资料，并全部行肝穿刺活检检查，经病理诊断确诊，并经HE染色复查认定。所有患者均签署知情同意书，并通过医院伦理委员会批准。

1.2 诊断标准 AIH采用美国肝病学会2010年推荐的诊断标准[6]；PBC采用欧洲肝病学会和美国肝病学会2009年诊断标准[7]。

1.3 方法 采用免疫组化SP方法将入选病例的肝穿石蜡切片进行染色，一抗：CD40(购自美国Santa公司)，工作浓度1∶1 000,；HLA-DR(购自美国Abcam公司)，工作浓度1∶1 500。二抗(以辣根过氧化物酶标记)：酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物，购于北京中杉金桥生物技术有限公司。试验结果的判断方法：在高倍镜视野(400倍)随机选择10个视野，计数每个高倍视野CD40、HLA-DR阳性细胞数，取均值。

1.4 统计学方法 使用统计软件SPSS 22.0 for Windows作统计学处理。CD40、HLA-DR的阳性细胞数采用均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，CD40、HLA-DR与临床生化、免疫指标的相关性，采用Pearson相关系数表示。

2 结果

2.1 CD40免疫组化染色结果 光镜下观察CD40免疫组化阳性产物：呈棕褐色或棕黄色颗粒状着色，主要位于细胞质，少部分位于细胞膜。CD40在AIH、PBC及对照组肝脏病理标本的表达：分别统计AIH、PBC、和对照组3组病例的CD40+细胞的数量绝对值，分别为:AIH为10±2；PBC为12±3；对照组为21±3。CD40在AIH、PBC、对照组患者3组间比较，其结果具有统计学意义(P=0.04，P<0.05)。AIH与PBC组比较无统计学差异(P=0.428,P>0.05)；AIH与对照组比较具有统计学意义(P=0.02，P<0.05)。

2.2 HLA-DR染色结果 光镜下观察HLA-DR免疫组化染色阳性产物呈棕褐色颗粒，主要位于细胞膜，少部分位于细胞质。HLA-DR在肝穿病理组织中表达局部可成片表达。HLA-DR在AIH、PBC及脂肪肝肝脏病理标本的表达：分别计算AIH、PBC和脂肪肝组3组病例的HLA-DR表达的阳性细胞计数绝对值，AIH为9±2；PBC为8±3；对照组患者中为17±1。HLA-DR在AIH、PBC及脂肪肝组3组患者比较其结果具有统计学意义(P=0.015，P<0.05)，AIH与脂肪肝组比较具有统计学意义(P=0.017，P<0.05)。

2.3 CD40与HLA-DR的相关性分析显示CD40与HLA-DR呈正相关，(r=0.851)。

2.4 CD40、HLA-DR与自身免疫性肝病患者的临床化验因素的关系 入选患者的基本情况见表1。CD40与肝病患者的生化结果相关性比较见表2。HLA-DR与肝病患者的生化结果相关性比较见表3。

3 讨论

自身免疫性肝病的具体发病机制至今未明,但有证据显示自身免疫性肝病中单核-巨噬细胞的吞噬能力下降[8]，抗原提呈能力减低，从而造成自身免疫功能的紊乱。近期研究提示单核-巨噬细胞功能异常与自身免疫性肝病的发病密切相关。正常人群的单核-巨噬细胞可吞噬抗原，以人白细胞抗原分子呈递给T淋巴细胞，激活细胞因子，启动特异性免疫-T细胞介导的抗原细胞凋亡，同时激活B细胞分泌特异性抗体。有研究显示自身免疫性肝病动物模型的单核-巨噬细胞的吞噬能力降低[8]，使细胞凋亡降解的产物，即凋亡小体大量不能及时被吞噬，导致凋亡小体大量积累、破裂，释放自身抗原，启动自身免疫反应。不仅如此，近期研究还发现自身免疫性肝病动物模型和患者血清的单核-巨噬细胞抗原提呈能力亢进，继而刺激T细胞及B细胞大量增殖亦加重了自身免疫反应。由此可见固有免疫中单核-巨噬细胞的功能紊乱是导致自身免疫性肝病发病的重要因素。

表1 入选病例的基本情况

注：ALT:谷丙转氨酶，AST：谷草转氨酶，ALP：碱性磷酸酶，GGT：谷氨酰转肽酶，TBIL：总胆红素，ALB：白蛋白，TP：总蛋白。

表2 CD40与肝病患者的生化结果相关性

CD40与AIH的ALT、AST具有相关性(*P<0.05)。

表3 HLA-DR与肝病患者的生化结果相关性

HLA-DR与AIH的ALT、SAT具有相关性(*P<0.05)。

CD40的分子质量为48-50 KD，属I型跨膜糖蛋白，是肿瘤坏死因子受体超家族成员之一[9]。主要表达于不同分化阶段的B细胞、T细胞、单核-巨噬细胞、树突状细胞(DC)等[10]。CD40与其配体(CD40L)相互作用，广泛参与免疫应答调节和炎症反应，包括细胞增殖、成熟、凋亡，以及调节包括细胞因子、趋化因子和黏附分子在内的炎症介质的表达。CD40-CD40L共刺激途径是指在首先未活化的抗原提呈细胞处理抗原，形成MHC-抗原肽复合物，再以MHC-抗原肽复合物的形式向幼稚的T淋巴细胞传递信号(第一信号)，上调T淋巴细胞表面CD40L分子的水平；其次T淋巴细胞表面的CD40L分子与抗原呈递细胞CD40相结合，经活化的抗原呈递细胞可以上调B7-1、B7-2等共刺激分子，增强了共刺激的活性，传递第二信号，进一步以活化T淋巴细胞[9]。专职抗原呈递细胞表面的MHC -II类分子结合其相应配体，发生交联以后可以通过激活不同的信号转导途径来引起其效应细胞的某些功能的改变，引起各种效应发生，参与效应细胞的活化、增殖、分化，上调协同刺激分子的表达、分泌细胞因子以及细胞凋亡等生物行为和功能的变化。

Schmilovitz的研究发现慢性病毒性肝炎、爆发性肝炎和肝细胞癌患者血清sCD40的浓度较健康人显著增高(P<0.001)[11]。研究发现血清sCD40的浓度与丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬酸氨基转移酶(AsT)明显正相关，提示血清sCD40可作为肝损伤的评价指标[11]。HLA-DR是一种MHC-II类分子，含有2个分子量分别为36kD和27kD的亚基(α亚基和β亚基)；HLA-DR表达于B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、活化T淋巴细胞、活化NK淋巴细胞等[12]。

本实验中，我们观察到自身免疫性肝病肝脏kupffer细胞表面抗原提呈分子HLA-DR类分子较非自身免疫性肝病患者数量减少，而协同刺激分子CD40表达较非自身免疫性肝病患者亦减少，两组试验结果均具有统计学意义。比较CD40与HLA-DR的相关性，我们发现CD40与HLA-DR呈正相关，提示在MHC-Ⅱ类分子表达下降的同时，共刺激分子CD40的表达也下降。我们推测自身免疫性肝病患者的抗原呈递分子HLA-DR及其共刺激分子CD40数量减少，表达下降，导致不能正常启动免疫应答反应，使免疫功能发生紊乱。单核-巨噬细胞抗原提呈功能的下降会导致非致病性外来抗原、病毒或细菌以及自身凋亡小体不能及时被吞噬、清理，而在体内堆积，引起并加重炎症反应，导致肝脏功能进一步损伤。

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Expression of CD40 and HLA-DR in Kupffer Cells of Autoimmune Liver Disease

LIHong-xia,GUOLi-ping,ZHANGJun,etal.

(TianjinTEDAHospital,Tianjin300457,China)

Objective To study the expression changes of Kupffer cell antigen presenting molecules in autoimmune liver disease.Methods Patients were divided into autoimmune hepatitis (AIH) group,primary biliary cholangitis(PBC) group,while fatty liver l hepatitis as a control group.Immunohistochemical staining of CD40 and HLA-DR were performed,random selection of 10 high-power mirror field of vision (400 times),then compare the differences with variance analysis.Results The number of the positive cells in the autoimmune liver disease group was lower than that in the control group.The positive product is brown granular or brown stain,mainly located in the cell membrane,little part is located in the cytoplasm.The results showed that there was statistical significance (P=0.04,P< 0.05)among the three groups.There was no significant difference between the AIH group and the PBC group (P=0.428,P>0.05).There was significant difference between AIH and NALD(P=0.02,P<0.05).(3) HLA-DR in autoimmune hepatitis group,the positive cells was lower than the control group,the staining positive products were brown particles,mainly located in the cell membrane.The absolute value of HLA-DR positive Kupffer cell count was calculated and the results showed that the 3 groups had statistical significance (P=0.015,P<0.05),There was no statistically significant between AIH and NALD (P=0.017,P<0.05).(4) CD40 and HLA-DR showed a positive correlation.(5) CD40,HLA-DR showed correlation withALT/AST in AIH.Conclusion CD40 and HLA-DR in patients with autoimmune liver disease was less than that of non autoimmune liver disease,and CD40,HLA-DR and liver function damage is correlated.It suggested that autoimmune liver disease may be weakened by Kupffer cell antigen presenting function,which is one of the causes of liver damage in autoimmune liver diseases.

autoimmune hepatitis disease;antigen-presenting;liver disfunction

天津市滨海新区卫生局科技项目(2013BWKY017)

1007-4287(2017)08-1350-04

R575.1

A

2016-12-10)