可手术切除的Ⅲa期NSCLC术中检测血浆游离DNA的意义

张晓凯，王 哲，戴昕伦，邹勤光，贾春祎，张立新，王启文*

(1.吉林省肿瘤医院 胸外二科，吉林 长春130012;2.吉林大学临床医学院)

*通讯作者

可手术切除的Ⅲa期NSCLC术中检测血浆游离DNA的意义

张晓凯1，王 哲1，戴昕伦2，邹勤光1，贾春祎1，张立新1，王启文1*

(1.吉林省肿瘤医院 胸外二科，吉林 长春130012;2.吉林大学临床医学院)

肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升趋势。2010年我国新发肺癌病例数高居恶性肿瘤榜首[1,2]。 非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌中最常见的类型，约占所有肺癌总数的80%，大多数NSCLC患者确诊时已处于中、晚期，我们对于其中可完全切除的部分Ⅲa期非小细胞肺癌，术前及术后3年内定期检测血浆游离DNA，通过分析非小细胞肺癌患者治疗前后血浆游离 DNA水平的变化，可间接反映肺癌患者体内的肿瘤负荷，对于微小残留病灶导致肿瘤转移及复发的监测，并在肺癌临床疗效的评价中具有一定的应用价值，值得进一步推广应用。

1 资料与方法

1.1 收集 2013年6月-2013年12月我科收治的非小细胞肺癌患者 89 例，男性，58例，女性，31例，年龄 43 -76 岁，中位年龄 52.4 岁; 所有患者术前均有细胞病理学证据确诊为非小细胞肺癌，89例患者均行手术治疗，61例行胸腔镜下肺癌根治术，28例开胸行肺癌根治术，术后病理，腺癌49例，鳞癌 34例 其他6例，术后病理分期均为Ⅲa期，术后均行含铂两药方案辅助化疗4周期，89例病人在术前，术后3周，术后3个月，12个月，24个月，36个月行血浆游离DNA检测。同时对门诊行健康体检者65例作为对照组,男性,43例,女性,22例,年龄 39-65岁，中位年龄 46.7岁。

1.2 血浆标本采集

分别抽取检测对象前臂静脉血4 ml，(肺癌患者在术前及术后定 期进行抽血)放入EDTA 抗凝管中，室温放置 2 h 后用低温高速离心机 20 ℃ ，离心半径15 cm，3 000 r /min，离心10 min，取上层血浆放入冻存管，置于-80 ℃ 冰箱保存备用。

1.3 血浆 DNA 提取及浓度检测

血浆游离 DNA 用 QIAamp DNA Blood Mini Kit 试剂盒( 德国，Qiagen 公司) 提取。提取的血浆游离 DNA 置于-20 ℃ 冰箱保存备用。采用实时荧光定量PCR法进行血浆循环肿瘤 DNA的检测。实时荧光定量 PCR 使用SYBR( TaKaRa 公司) 试剂盒，用已知浓度的 DNA 标准品得到的 ct 值绘制标准曲线。ct 值与 DNA 含量的对数存在线性关系，用实时荧光定量 PCR仪自带的分析软件根据样品中的ct值得到样品浓度。

1.4 统计学分析

应用SPSS12.0软件统计数据,血浆游离 DNA 水平以χ2±s表示，组间比较应用t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

此89例患者均行手术治疗，无论其病理分型如何,术前其血浆游离DNA(cfDNA)均高于门诊健康体检者,其含量约为健康人的 10 倍以上,差异具有统计学意义(P<0.01)见表1。病人术后3周的血浆游离DNA明显低于术前,与术前比较差异具有显著性(P<0.01)见表2,术后3月,12月变化不大。而不同病理分型分组比较,肺腺癌与肺鳞癌的患者血浆游离DNA水平比较无显著性(P>0.05)见表2。术后24月检查时,有12人明显升高,术后36月检查时有19人明显升高,结合其他检查,发现均有局部复发或远处转移.其中支气管残端复发3例,纵隔淋巴结转移4例,远处脏器(肝脏,脑,多发骨)转移12例，与未发现复发及远处转移患者比较具有显著性(P<0.01)，见表3。

表1 肺癌组(术前)与对照组血浆游离DNA(cfDNA)水平 (ng/ml)

表2 不同病理类型肺癌及术前,术后3周，3月,12月血浆游离DNA(cfDNA)水平 (ng /ml)

表3 术后24月,36月血浆ctDNA水平(ng/ml)

3 讨论

血游离DNA又称循环DNA，是指血液循环中具有DNA双螺旋结构的核苷酸片段，在血液中,大部分以游离形式存在，称为游离DNA(cell-free DNA cfDNA)其余部分通过与蛋白质结合成复合物或附着在细胞表面[3]，Anker等[4]研究表明，正常人血游离DNA大多来源于血细胞，其含量极低，在100 μg/L 之下，平均约为 30 μg/L 。而肿瘤患者的外周血游离 DNA 主要来源于肿瘤细胞坏死凋亡后扩散，或增生活跃肿瘤细胞的释放。肿瘤细胞在坏死、凋亡后释放出可以在人体血液系统中不断循环的肿瘤基因组游离 DNA 片段，其浓度可高达1000 μg/L，平均值为180 μg/L[5]。本组肺癌患者的血浆游离 DNA 明显高于健康体检人群，其含量约为健康人的 10 倍以上，说明行血浆游离 DNA 检查是对肺癌高危人群的早期筛查和早期诊断的一个重要手段，Chan等[6]研究也证明肺癌患者与健康人的血浆游离 DNA 含量之间存在显著性差异，检测血浆游离 DNA 水平可用于肺癌的早期筛查。本研究提示血浆游离DNA含量与病理类型无明显相关性，与国外学者Szpechcinski 等[7]的研究结果相一致，但国内张弦等[8]研究，结果是肺腺癌患者血浆游离 DNA 水平要高于肺鳞癌患者。是否因为不同组织学类型的非小细胞肺癌存在代谢组学及基因组学上的差异，还可能存在增殖动力学上的差异，有待进一步验证。另外本组89例病人完全切除病人术后3周的血浆游离 DNA 明显低于术前,术后3月,12月变化不大,原因是手术彻底切除了原发病灶，表明血浆游离 DNA 能实时体现肺癌患者体内肿瘤负荷的变化情况，并在一定时期内检测血浆游离 DNA 水平，无上升趋势，表明经手术及术后辅助化疗后病情得以有效控制，当24月检查时,有12(12/89 13.5%)人升高,术后36月检查时有19人(19/89 21.3%)升高,结合其他检查,发现均有局部复发或远处转移.与Madhavan[9]等研究结果相一致，造成此结果的原因是，晚期肺癌患者肿瘤负荷量增加，肿瘤细胞数量大，脱落，坏死机会增多，此时检测血浆游离 DNA 可提示血浆cfDNA含量过高，预示了病情的严重程度，这对于早期发现肿瘤复发及转移提供了一项重要依据，当发现有异常增高时，说明肿瘤负荷高，应及早行全身检查，找到复发病灶或转移病灶，及时给予包括全身化疗，放疗，靶向治疗，及免疫治疗等综合治疗，另外通过检测肺癌患者血浆游离 DNA 还可以在靶向治疗药物选择及靶向治疗耐药实时检测提供依据[10]。

综上，血浆游离 DNA 检测，具有高度特异性及灵敏性，取材方便，易于被病人接受，对于肺癌早期诊断，肿瘤治疗疗效的评估及判断肿瘤是否有复发及进展等方面具有一定的应用价值。

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1007-4287(2017)08-1343-03

2016-08-14)