UPLC-ESI-MSn法测定糖痹康颗粒入血成分研究＊

王东超，魏颖，高佳琪，刘一冰，屈玲霞，刘永巧，徐暾海＊＊，刘铜华

UPLC-ESI-MSn法测定糖痹康颗粒入血成分研究＊

王东超1,2,3，魏颖1,2,3，高佳琪1,2,3，刘一冰1，屈玲霞1,2,3，刘永巧1,2,3，徐暾海1,2,3＊＊，刘铜华2,3

（1.北京中医药大学中药学院北京100029；2.北京中医药大学中医养生学教育部重点实验室北京100029；3.北京中医药大学中医养生学北京市重点实验室北京100029）

目的：通过UPLC-ESI-MSn方法定性分析糖痹康颗粒（TBK）的入血成分，初步阐明糖痹康颗粒的药效物质基础。方法：采用UPLC-LTQ-Orbitrap高分辨液质联用仪，在电喷雾离子源的正、负离子模式下，对空白血清、糖痹康颗粒经大鼠给药后的含药血清进行检测。根据离子碎片信息，偶电子规律，氮规则等并结合相应参考文献，定性分析并鉴定入血成分。结果：糖痹康颗粒灌胃给药后，在大鼠血清中发现15个入血成分，其中13个是以原型成分被吸收，其余2个可能为代谢产物。结论：糖痹康入血成分是各组方药味配伍后共同作用的结果，在大鼠血清中，多数成分已经被大鼠代谢吸收，少数以原型成分吸收。本实验为糖痹康颗粒的药效物质基础和体内代谢研究提供参考。

糖痹康颗粒UPLC-ESI-MSn入血成分药效物质基础

糖痹康颗粒（专利申请号：200810167551.1）主要由黄芪、桂枝、黄连、延胡索、鸡血藤、黄芩、女贞子、水蛭组成，具有益气养阴、解毒化瘀通络功效，对治疗糖尿病周围神经病变具有良好的效果[1-5]。临床研究表明糖痹康颗粒对糖尿病周围神经病变患者的肢体麻木、疼痛、感觉异常等症状改善明显，对神经传导速度和末梢微循环有明显的改善作用[6]。糖痹康在临床试验中对糖尿病周围神经病变具有明显改善，但是要进一步研究其药效物质基础和作用机制，需要更深入的研究，本实验初步研究了糖痹康颗粒经SD大鼠口服后的入血成分，希望通过对入血成分的鉴定，找到使糖痹康发挥药理作用的有效成分，为其作用机制研究提供参考。

1 仪器和试药

1.1 仪器

Thermo Scientific TM LTQ Orbitrap XL hybrid FT⁃MS instrument高分辨率质谱（德国Thermo公司）；ML54/02电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；3K15型Sigma低温高速离心机（德国Sigma公司）；ACQUITY UPLC®BEH C18Column（130Å，1.7µm，2.1 mm×100 mm，美国Waters公司）。

1.2 试剂

糖痹康颗粒为北京中医药大学提供（批号：20150401）；戊巴比妥钠（德国Merck公司，批号：bm-007）；乙腈（色谱纯，美国Sigma-aldrich公司）；甲酸（美国Fisher公司）；水为Millipore-Q自制超纯水。

表1 取血清时间表

表2 TBK色谱梯度洗脱条件

1.3 实验动物

SPF级雄性SD大鼠30只，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，合格证号：SCXK-（军）2012-0004，体重290-330 g，饲养于SPF环境，温度20℃-25℃，湿度45%（40%-70%），光照12h（7:00-19:00），噪音＜60分贝。

2 实验方法

2.1 给药途径和方法

将SD大鼠随机分为TBK给药组15只、正常组15只，适应性喂养7天后，开始灌胃给药。糖痹康按照成人剂量的10倍给药；正常组给与相同体积蒸馏水。每日灌胃1次，连续灌胃7日。

2.2 含药血清样品采集

所有大鼠实验前禁食12 h（自由饮水），大鼠称重后，按照表1时间点麻醉（30 g·L-1至1 mL·kg-1的戊巴比妥钠溶液）后肝门静脉取血。收集血清，静置2 h后，4℃，4 000 rpm离心15 min，取上清，作为各个时间点的含药血清，备用。

2.3 含药血清样品处理

取空白及含药血清各0.5 mL，加2.5 mL乙腈，涡旋30 s后，4℃，4 000 rpm离心10 min，取上清液，35℃下氮气吹干，加200 μL甲醇，涡旋30 s，复溶，4℃，13 000 rpm离心10 min，取上清液，备用。

2.4 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC®BEH C18Column（130Å，1.7µm，2.1 mm×100 mm）；流动相：A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：乙腈；流速：0.4 mL·min-1；柱温：40℃；检测波长：254 nm；进样量：0.2 μL；梯度洗脱程序见表2。

2.5 质谱条件

正离子模式：毛细管温度：350℃；鞘气流速：40 arp；辅助鞘气流速:20 arp；喷雾电压：4 kV；源电流：100 μA；毛细管电压：25 V；管透镜电压：110 V；负离子模式：毛细管温度：350℃；鞘气流速：40arp；辅助鞘气流速：20arp；喷雾电压：3 kV；源电流：100 μA；毛细管电压：-35 V；管透镜电压：-110 V；样品采用高分辨巧进行全扫描（Fullscan，FS），分辨率R设为30 000，扫描范围m/z 50-1 500 amu；二级和三级质谱采用动态DDS扫描，CID激活单位化25 q，激活时间30 ms，归一化碰撞能量为35%，以离子阱打拿极检测碎片离子。设置动态排除（DE），重复次数：30，重复时间：30 s，排除清单大小：500，排除时间：60 s。

3 结果

3.1 专属性考察

取“2.2”项下的含药血清和空白血清进样（图1），虽然含药血清和空白血清总离子流图无明显差异（图2），可以精确提取出入血成分的离子流图，表明内源性物质对测定无干扰。

3.2 化学成分分析

含药血清样品按照“2.4”、“2.5”项下方法进样，详细分析，通过保留时间、精确分子量以及离子碎片信息解析色谱峰，进行成分指认和鉴定，从而确定TBK入血原型成分和可能的代谢产物。经分析，共检测出13种原型成分，2种代谢产物，可视为糖痹康颗粒的入血成分。

3.2.1 原型成分分析

通过体外TBK、含药血清和空白血清的LC-MS/ MS分析，可以检测到血清中多种成分（表3）。

3.2.2 代谢产物分析

在含药血清中检测到多种生物碱，故在血清中能够检测到生物碱代谢物的几率很大。通过对m/z 50-550间主要离子的LC-MS/MS分析，2个二级质谱中观察到M-176，见表4。葡糖醛酸结合物是体内最常见的的代谢产物存在形式[13-15]。由此推测这2个化合物是生物碱与葡萄糖醛酸结合物。在血清中，生物碱既以原形存在，也以与葡萄糖醛酸结合的形式存在。通过MS/MS数据推测2个这样离子可能存在的结构（图2）。虽然明确是生物碱与葡萄糖醛酸结合物，但是生物体内代谢复杂，TBK成分多样且含有同分异构现象，只依靠质谱很难断定其结构，其代谢结构可能还需要其他技术来鉴定区分。

图1 含药血清和空白血清总离子流图

4 总结与讨论

本实验首次应用UPLC-ESI-MSn对糖痹康颗粒入血成分进行分析，该方法效率高、稳定性好、灵敏度高，能快速检测出含量较低的化学成分，优于其他方法。在血清处理的时间点上，分别在0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10、12 h时间点取血清，通过质谱总离子流图的信息比对，发现在0.5、1、1.5 h等时间点没有发现不同，色谱信息大致相同，故选择1 h进行数据分析。在血清处理上，为了在血清中获得更多的数据信息，没有采用SPE小柱法，通过比较乙腈沉淀法、甲醇沉淀法、乙酸乙酯沉淀法等方法，结果选择了特征峰图谱信息丰富的乙腈沉淀法。

在前期对糖痹康颗粒的体外成分研究中，发现该颗粒含有黄酮类、生物碱类、单萜苷类、苯乙醇苷类、酚酸类等50多种成分，但在本次实验中，只检测出13个原型成分和2个代谢产物，这些化合物可能来自黄芩、女贞子、黄连、延胡索。糖痹康颗粒的入血成分来源于该复方的各味组成方药，黄芩中黄酮类成分具有抗炎作用，女贞子中红景天苷具有养阴效用，黄连和延胡索中的生物碱类具有降糖作用，糖痹康颗粒治疗糖尿病周围神经病变的药效也是各味药材相辅相成作用的结果。本次实验只发现少数原型成分和代谢产物，原因可能是生物机体内代谢通路途径复杂，多数已经快速入血，并被机体代谢，只检测到少数成分。通过本次实验可以为糖痹康颗粒的药效物质基础研究以及体内活性作用机制提供参考。

图2 质谱数据和M1（A）、M2（B）结构图

表3 入血化学成分鉴定表（正/负离子模式）

续表3

表4 2个代谢产物LC-MS/MS数据

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Research on Component Determination of Tang-Bi-Kang Granules in Rat Serum by UPLC-ESI-MSnMethod

Wang Dongchao1,2,3,Wei Ying1,2,3,Gao Jiaqi1,2,3,Liu Yibing1,Qu Lingxia1,2,3, Liu Yongqiao1,2,3,Xu Tunhai1,2,3,Liu Tonghua2,3
(1.Collage of Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China; 2.Key Laboratory on Health Cultivation,the Ministry of Education,Beijing 100029,China; 3.Beijing Key Laboratory of Health Cultivation,Beijing 100029,China)

Through comprehensively characterizing components in blood after oral administration of Tang-Bi-Kang (TBK)granules by UPLC-ESI-MSn,this study was aimed to explain the pharmaceutical material basis of TBK initially. UPLC-LTQ-Orbitrap was used under both positive and negative ion modes of electrospray ionization.The blank serum and rat serum after oral administration of TBK were analyzed.Components in rat serum were identif i ed and characterized based on ion fragment information,evenelectron law,nitrogen rule and so on.Reference data was used to establish the UPLC-ESI-MSnmethod.The results showed that after oral administration of TBK granules,15 components were detected in the serum,of which 13 components were taken as the prototype to blood and 2 metabolites.It was concluded that constituents of TBK granules in rat serum were generated from compatibility of all herbal medicines.In rat serum,most of the components had been absorbed by rat’s metabolism;a few were absorbed as the prototype.This research provided references for pharmacodynamic material basis and metabolism of TBL granules in vivo.

Tang-Bi-Kang granules,UPLC-ESI-MSn,components in serum,pharmaceutical material basis

10.11842/wst.2017.05.012

R917

A

（责任编辑：韩馥蔓，责任译审：王晶）

2017-04-17

修回日期：2017-05-20

＊科学技术部国家“重大新药创制”科技重大专项（2012ZX09102201-001）：治疗糖尿病周围神经病变药物糖痹康临床前研究，负责人：刘铜华；北京中医药大学创新团队—中医药干预糖尿病及其并发症研究团队（2011-CXTD-19），负责人：刘铜华。

＊＊通讯作者：徐暾海，教授，博士生导师，主要研究方向：中药活性成分及其质量控制研究。