水稻根际固氮菌N X-2的分离鉴定及其培养条件优化

杜 宇，李来梅，雷 潇，杜东霞，尹红梅，刘 标，许 隽

（湖南省微生物研究院，湖南 长沙 410009）

水稻根际固氮菌N X-2的分离鉴定及其培养条件优化

杜 宇，李来梅，雷 潇，杜东霞，尹红梅，刘 标，许 隽

（湖南省微生物研究院，湖南 长沙 410009）

筛选高效固氮能力的植物根际促生菌是研发微生物肥料的关键。研究从水稻根际土壤中分离筛选得到一株固氮菌NX-2，利用乙炔还原法测定其固氮酶活可达16.18 µmol /(mL·h) （以C2H4浓度计）。通过形态观察、生理生化特性和16S rDNA序列分析，菌株NX-2被鉴定为褐球固氮菌。进一步研究其生长特性，结果显示最佳培养条件为培养温度28℃、初始pH值6.5、接种量3%。

水稻根际；固氮微生物；分离；鉴定；培养条件优化

氮是水稻生长发育的必要营养元素，自然状态下土壤中的氮素含量很难满足水稻对养分的需求。但是依照目前粗放型的施肥习惯，稻田施加的氮肥被水稻吸收利用的效率并不高，而且氮肥容易在土壤中大量残留，进而污染环境[1]。空气中大量氮元素以游离状态存在，不能被生物体直接利用，固氮微生物能够利用体内特殊的固氮酶把空气中的氮气还原成植物可利用的分子态氨[2]。在植物根际中也存在一类能保护和促进植物生长发育的细菌，被称为植物根际促生细菌（Plant Growth Promoting Rhizobacteria, PGPR），约有2%～5%的根际细菌是PGPR[3]。植物根际固氮菌是一类重要的PGPR，定植于根表和近根土壤中，除了固氮作用外，还具有促进土壤有机质的矿化、分泌植物激素等促生长的作用[4]。自生固氮菌种类很多，主要包括圆褐固氮菌、贝氏固氮菌、巴斯德固氮梭菌等[5]。在法国、美国等国家已经有研究证明把固氮螺菌接种到玉米上，可取代20%～30%的氮肥，同时增产10%～20%[6]。目前，固氮微生物肥料的研究方向正在从研制豆科植物根瘤菌剂转向禾谷类作物的固氮肥料上来，其中禾谷类自生固氮菌和联合固氮菌的选育是重点和难点[7]。因此，研究以水稻根际土壤为材料从中筛选出一株具高固氮酶活性的菌株，经生理生化和分子生物学鉴定后，对该菌株的最适培养条件进行了优化，以期为禾谷类固氮肥料的研制打下基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

水稻根际土壤样品采自湖南宁乡回龙铺，取样时先去掉地表土，选择附有水稻根系的土壤。阿须贝无氮培养基：葡萄糖10 g，KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaSO40.1 g，CaCO35 g，双蒸水1 000 mL，pH值为7.0；固体培养基加2 %的琼脂粉，半固体培养基加0.5 %琼脂粉。LB培养基：胰蛋白胨10 g，氯化钠10 g，酵母提取物5 g，双蒸水1 000 mL，pH值为7.0。

1.2 试验方法

1.2.1 固氮菌的分离筛选 取10 g附在水稻根上的松散土，溶于90 mL无菌水中，摇床振荡30 min制成菌悬液，采用10倍稀释法，把各稀释倍数的菌液涂布在阿须贝无氮培养基上，28℃培养3 d，将形态不同的单菌落通过平板划线分离纯化。

1.2.2 固氮酶活的测定 采用乙炔还原法，将固氮菌接种于含有10 mL半固体阿须贝培养基的25 mL血清瓶中，28℃培养2～3 d，把血清瓶盖更换成橡胶塞，用无菌注射器抽取1/10体积的空气，注入等体积的乙炔，28℃继续培养1～4 d，抽取50 µL混合气体注入气相色谱仪，测定乙烯生成量，酶活单位用单位体积的发酵液在单位时间内生成乙烯的微摩尔数表示，参照文献[8]测定固氮酶活。

1.2.3 菌种鉴定 提取固氮菌总DNA，以细菌16S rDNA通用引物27-F：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3'；1492-R：5'-AAGGAGGTGATCCARCCGCA-3'进行PCR 扩增，PCR 产物纯化后送样上海生工进行DNA测序，序列通过NCBI数据库进行Blast分析，与数据库中的序列进行同源性比较。

1.2.4 菌种生长特性分析 按1%的接种量将菌株NX-2种子液转接至100 mL基础培养基，分别置于24、26、28、30、32℃摇床上发酵培养24 h，测定发酵液的菌数，确定最佳培养温度；调节基础培养基的pH值分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，在最佳培养温度条件下发酵培养24 h，测定发酵液的菌数，确定最佳初始pH值；在最佳培养温度和初始pH值条件下，分别按1%、2%、3%、4%、5%接种，发酵培养24 h，测定发酵液的菌数，确定最佳接种量。

2 结果与分析

2.1 水稻根际固氮菌的分离筛选

在阿须贝无氮培养基上初筛得到了多株形态、颜色各异的固氮菌株。其中，菌株NX-2在无氮培养基上长势较好，如图1所示，菌落为圆形半透明，边缘整齐，表面湿润，不易挑起，能够产生粘液。在显微镜镜下观察为杆状，有荚膜。

图1 固氮菌株NX-2的菌落形态

2.2 菌株NX-2固氮酶活性

固氮酶活是评价固氮菌性能的重要指标，固氮酶可以催化乙炔还原成乙烯，用气相色谱仪检测乙烯的生成量，间接测定固氮酶活性。在密封的血清瓶中注入乙炔后，分别培养1、2、3、4 d检测酶活性，结果如图2所示。由图2可知，培养1～4 d检测固氮酶活分别为0.87、4.30、15.13、16.18 µmol/(mL·h) （以C2H4浓度计），说明菌株NX-2具有较高的固氮酶活性。

图2 固氮菌株NX-2的固氮酶活性

2.3 菌种鉴定

对菌株NX-2进行常规的生理生化特性分析，结果表明该菌株革兰氏染色和氧化酶反应为阴性，淀粉水解、过氧化氢酶、M.R.、V.P.、硫化氢反应均为阳性，表明该菌株可以利用葡萄糖、果糖、甘露醇等碳源。这些生理生化特性与《伯杰氏细菌鉴定手册》中对褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum）的描述一致。提取菌株NX-2的基因组DNA，PCR扩增16 S rDNA片段，将测序结果在NCBI网站上进行BLAST分析，发现NX-2与Azotobacter chroococcum AM12A菌株（GenBank：AB430880）的同源性为99.6%，结合生理生化特性确定NX-2菌株为褐球固氮菌。

2.4 NX-2菌株的最适培养条件

2.4.1 最佳培养温度 分别在24～32℃温度条件下对菌株NX-2培养24 h，如图3所示，在28～32℃条件下活菌数均超过108CFU/mL，其中当温度为28℃时达到2.73×108CFU/mL，活菌数最高。故可认为菌株NX-2的最佳培养温度为28℃。

图3 培养温度对菌株NX-2生长的影响

2.4.2 最佳初始pH值 分别在初始pH值为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的条件下对菌株NX-2进行培养，如图4所示，菌株NX-2在pH值6.0～7.0范围内生长较好，说明该菌株有一定的耐酸能力。因此，将初始pH值设定为6.5，菌株NX-2活菌数最高，达到3.4×108CFU/mL。

图4 初始pH值对菌株NX-2生长的影响

2.4.3 最佳接种量 如图5所示，当接种量为1%～5%时，活菌数分别为2.93×108、4.83×108、6.10×108、6.57×108、6.53×108CFU/mL。随着接种量的增加，菌株NX-2的活菌数呈上升趋势；但当接种量超过3%时，活菌数增加不明显，因此选择3%作为菌株NX-2的最佳接种量。

图5 接种量对菌株NX-2生长的影响

3 结论与讨论

从水稻根际土壤中分离筛选得到一株固氮菌NX-2，利用乙炔还原法测定其培养4 d时固氮酶活为16.18 µmol /(mL·h) （以C2H4浓度计），具有较高的固氮酶活性。通过生理生化特性和16 S rDNA序列分析，菌株NX-2被鉴定为褐球固氮菌。褐球固氮菌属于假单胞菌目假单胞菌科褐球固氮菌属，已经有研究表明褐球固氮菌可以用于微生物肥料。对固氮菌NX-2的最适培养条件进行了优化，结果表明最适培养条件为培养温度28℃、初始pH值6.5、接种量3%。菌株NX-2有一定的耐酸能力，而目前湖南稻田土壤普遍为弱酸性和酸性，十分有利于菌株NX-2的定植。同时，该研究为水稻固氮促生微生物菌肥的研发提供了菌种资源。研究显示，大部分根际固氮微生物还有促进作物生长的能力，后续将朝着这一方向努力，研究菌株NX-2对水稻的促生效果。

[1] 巨晓棠，谷保静. 我国农田氮肥施用现状、问题及趋势 [J]. 植物营养与肥料学报，2014，20（4）：783-795.

[2] 沈世华，荆玉祥. 中国生物固氮研究现状和展望[J]. 科学通报，2003，48（6）：535-540.

[3] 徐洪海. 植物生长促进菌（PGPR）对大豆种子发芽效果初探[J].当代生态农业，2007，（1）：27-28.

[4] 胡江春，薛德林，马成新，等. 植物根际促生菌（PGPR）的研究与应用前景[J]. 应用生态学报，2004，15（10）：1963-1966.

[5] 郭维烈. 实用微生物技术[M]. 北京：科学技术文献出版社，1991.

[6] 沈阿林，王永歧. 微生物肥料研发现状及其应用前景[J]. 河南农业科学，2004，（4）：34-36.

[7] 祝凌云. 水稻根际促生菌的筛选及对水稻的促生作用[D]. 合肥：安徽农业大学，2008.

[8] 赵 斌，何绍江. 微生物学实验[M]. 北京：科学出版社，2002.

（责任编辑：成 平）

Isolation, Identification and Optimization of culture conditions of Nitrogen-Fixing Bacteria NX-2 from Rice Rhizosphere

DU Yu，LI Lai-mei，LEI Xiao，DU Dong-xia，YIN Hong-mei，LIU Biao，XU Jun
（ Hunan Academy of Microbiology, Changsha 410009, PRC）

It is a key issue to screen the rhizosphere promoting bacteria of high efficient nitrogen fixing ability for the development of microbial fertilizer. In this study a nitrogen-fixing bacteria NX-2 was isolated from rice rhizosphere soil. Nitrogenase activity was measured by acetylene reduction at 16.18 µmol/(mL·h) calculated C2H4concentration. Through morphological observation, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis, the strain NX-2 was identi fi ed as Azotobacter. Its growth characteristics were further studied, the results showed that the optimal fermentation condition was the initial temperature 28℃, pH 6.5, inoculum size 3%.

rice rhizosphere; nitrogen- fi xing bacteria; isolation; identi fi cation; optimization of culture conditions

S144.5

：A

：1006-060X（2017）07-0001-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.007.001

2017-05-08

湖南省自然科学基金（2015JJ3084）

杜 宇（1979-），男，湖南长沙市人，工程师，主要从事农业微生物相关研究。

许 隽