D980nm激光不同治疗频次对SD大鼠皮肤紧肤效果的对比性研究①

黄信隆，张 威

(1.佳木斯大学研究生学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯大学附属第二医院，黑龙江 佳木斯 154002)

D980nm激光不同治疗频次对SD大鼠皮肤紧肤效果的对比性研究①

黄信隆1，张 威2

(1.佳木斯大学研究生学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯大学附属第二医院，黑龙江 佳木斯 154002)

目的：研究经过D980nm半导体激光不同治疗频次照射后，SD大鼠皮肤的胶原纤维、成纤维细胞、TGFβ1的变化，探讨激光对大鼠皮肤紧肤效果的对比性变化，旨在作为D980nm半导体激光今后研究的实验依据。方法：选取18只SD大鼠建立动物模型，分为I、II、III三组，每组6只，大鼠脊柱左侧皮肤作为激光照射实验组，脊柱右侧皮肤作为自身对照组。调节D980nm半导体激光仪设定参数，在皮下照射SD大鼠脊柱左侧皮肤，I组照射1次，II组照射2次，间隔2min，III组照射3次，间隔2 min，各组间隔1周处理一次，共3个疗程。第3个疗程结束休息1周后，引颈处死大鼠，背部皮肤脱毛取材切片，通过应用HE染色、免疫组化法，观察激光照射前后大鼠皮肤胶原纤维和成纤维细胞变化，检测分析TGFβ1表达在大鼠皮肤组织中的变化。结果：D980nm半导体激光进行皮下照射后大鼠皮肤胶原纤维含量增加、成纤维细胞数量增加、TGFβ1表达增强明显，其中激光照射3次组，大鼠皮肤胶原纤维含量、成纤维细胞数量增加、TGFβ1表达增强明显，定量分析与各组比较，有显著性差异(P<0.01)。结论：经D980nm半导体激光皮下照射后SD大鼠皮肤的紧肤效果明显，合适的治疗频次可以提高皮肤的紧肤效果，并且紧肤效果强弱和治疗频次有关。

激光；紧肤；胶原纤维；成纤维细胞；TGFβ1

皮肤重塑一直以来在人类史上都是人们梦寐以求的目标，其治疗技术发展层出不穷，从面部年轻化皮肤手术治疗[1]，脂肪移植改善皮肤质地治疗[2]，中药改善瘢痕皮肤治疗[3]，到现在激光重塑治疗，其中激光在最近几年发展迅速并用于治疗皮肤光老化，尤其是D980nm波长半导体激光作为激光治疗新模式在脂肪溶脂、改善瘢痕和治疗光老化方面已证实有一定的效果，并在临床治疗中有初步的应用，但目前临床上对于D980nm激光对皮肤起到紧肤效果的机制还有待进一步研究。而且，到现在为止激光的众多研究多限制于临床有效性的总结，而对其治疗机制的基础性研究甚少。并且临床上，患者进行激光治疗后，观察其皮肤组织结构的变化并不是特别方便，其具体机制还有待深入研究[4～6]。在人类皮肤中起关键构造并且分布最为广泛的细胞外基质成分是胶原纤维，关键是它确定了皮肤的强度和形态[7]。胶原由成纤维细胞合成，后者是作为皮肤真皮网织层中最主要的细胞[8]。较常见的有关创伤修复的细胞因子，主要是转化生长因子β1 (TGFβ1)，并且它是促使成纤维细胞增殖分裂的重要细胞因子，其中TGFβ1是促进成纤维细胞增殖的主要因子[9]。目前，成纤维细胞、胶原纤维、TGFβ1细胞因子在D980nm波长半导体激光紧肤中的定量分析和评估至今鲜有报道。我们以SD大鼠建立动物模型，经D980nm激光不同治疗频次后，观察大鼠皮肤组织结构变化，并检测分析成纤维细胞、TGFβ1因子在大鼠皮肤组织中的变化情况。

1 材料和方法

1.1 实验动物及主要仪器、试剂

随机选取清洁级18只SD大鼠，雄性，体重400～450g，12～14个月龄，由佳木斯大学动物实验中心供应饲养。德国塞拉姆D980激光治疗仪(Ceramoptecgmbh公司，德国)。兔抗人TGFβ1多克隆抗体，SABC检测试剂盒，均购于武汉博士德生物有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 建模方法

将SD大鼠18只，随机标号分为3组，每组6只，标为I、II、III3组。激光前动物预备麻醉，对大鼠进行称重计算所用麻醉剂量 (300mg/kg)，然后用10%的水合氯醛溶液以腹腔注射的方式进行充分的麻醉，待麻醉显效后，实验中以大鼠脊柱为分界线分为左右两个对称区域，每个区域为3cm×3cm，左侧为实验区域，常规脱毛、肿胀麻醉后，供使用D980nm激光对皮下组织进行处理，右侧对称部位为对照区域，只做常规脱毛、肿胀麻醉，不做其他处理。每侧脱毛暴露区域为4cm×4cm。肿胀麻醉液：2%利多卡因1000mg+肾上腺素1mg+每升生理盐水含10mL碳酸氢钠。预标记区域皮下充分浸润麻醉。将大鼠固定在实验台上。根据临床、相关文献和预实验选出合适的激光嫩肤参数组合，脉冲模式下，采用D980nm波长行激光溶脂嫩肤，各实验组能量密度均保持20J/cm2，功率为8W，脉冲宽度为20ms，脉冲频率40Hz。I组用功率为8W的激光处理1遍，II组用功率为8W激光处理2遍，时间间隔为2min，III组用功率为8W的激光处理3遍，时间间隔为2min。各组每间隔1周处理一次，各组共3个疗程，当第3个疗程后停歇恢复1周。在实验组区域左下角作一直径为1mm的圆形微小切口，把激光仪的光纤探头套在金属导管内，把金属导管穿过微小切口进入实验组区域皮下脂肪组织进行均匀皮下照射，作用于皮肤真皮层和皮下脂肪层,用设计的实验方法作用于实验组，手术中用手持式红外测温枪监督并检测大鼠皮肤体表温度变化，照射体温要求小于42℃，手术后用冷凝胶均匀涂抹背部大鼠皮肤，并密切观察大鼠的状态。对照组不做处理。

1.2.2 标本取材、处理和染色

在大鼠第3个疗程结束休息1周后，引颈处死大鼠，脱净背部实验组和对照组各标记区域的体毛，用组织剪快速剪下各组标记区域的皮肤组织块，大小为1cm×1cm×0.5cm，标记清楚，在10%的中性福尔马林中固定。 固定48h后，常规石蜡包埋后按每张5μm厚度作连续切片。每批次实验均设阳性和阴性对照。阳性细胞判断及计数：随机选择每组6张免疫组化染色切片，在每张组织切片中随机选择5个400倍的高倍细胞视野，以真皮成纤维细胞或巨噬细胞的包浆出现黄或黄褐色着色作为阳性表达，记录每个视野中阳性表达的细胞总数。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 HE染色结果

各自身对照组：大鼠皮肤中胶原纤维数量较少，分散排列于真皮层中，且纤维之间空隙较大，成纤维细胞数目稀少(图1X)。各实验组间对比：I组为1次照射组显示胶原纤维数量变多，纤维空隙减少，但杂乱排列，成纤维细胞增加不明显(图1I)；II组为2次照射组显示胶原纤维数量上变多，纤维空隙略有减少，纤维增粗，似平行排布，成纤维细胞数量少量增加(图1II)；III组为3次照射组显示胶原纤维数量显著变多，纤维间空隙减少，排列整齐有序紧密，成纤维细胞数目明显增加(图1III)。从D980nm激光照射治疗后，实验组与自身对照组相比较，胶原纤维含量增多明显，形态上变粗，纤维间空隙减少，纤维排列紧密，走向与表皮平行分布，并且更加整齐有规则，成纤维细胞数量增多。见图1。

图1 D980nm激光不同治疗频次照射后皮肤胶原纤维和成纤维细胞变化 X.对照组(×100) I.1次照射组(×100) II.2次照射组(×100) III.3次照射组(×100)

2.2 TGFβ1表达结果

I、II、III三组治疗频次的激光进行皮下照射处理后，SD大鼠皮肤组织中的TGFβ1因子表达增强，其实验组阳性细胞数目显著高于自身对照组，并且有显著性差异(P<0.01)。两两比较，I组实验组和II实验组比较，TGFβ1表达呈现明显的差异，且差异有统计学意义(P<0.01)，III实验组数值结果显示TGFβ1表达增强最明显，与I、II实验组比较，组间差异有统计学意义(P<0.01)。见表1，图2。

表1 D980nm激光不同治疗频次照射后大鼠 皮肤中TGFβ1表达结果

图2 D980nm激光不同治疗频次照射后TGFβ1表达变化 X：对照组(×400) I：1次照射组(×400) II：2次照射组(×400) III：3次照射组(×400)

3 讨论

半导体激光是高强度光源激光，皮肤组织中多种吸色团即靶目标可同时吸收一定的光能，产生多种光热解效应，光热解效应的一个原则是靶组织吸收足够的热量产生组织的热损伤。组织损伤后即启动创伤愈合过程[10]。在研究激光进行皮下照射时，当足够的能量热损伤达到一定程度后仍能发生局部炎症反应，激光的热损伤愈合过程与别的因素引起的创伤愈合过程有一定的共同性和特殊性，在该愈合修复进程中，皮肤胶原纤维、成纤维细胞和细胞因子变化规律是如何的。

在激光溶脂中，激光可直接破坏液化脂肪细胞，并且激光的热效应能够减少出血，促进皮肤收紧。最早JA Muccini，FE O'Donnell等研究在光老化致皮肤松弛胶原变性后可采用980 nm半导体激光治疗光老化所导致的纤维组织病变[11]。有研究得出激光形成的生物光热作用,造成胶原纤维面积增加[12]。有人在采用D980nm激光照射的动物研究中，结果表明I型胶原纤维含量实验组显著高于对照组[13]。成纤维细胞(fibroblast)是疏松结缔组织中数目最多、最多见的细胞成分，可划分为成纤维细胞和纤维细胞，它对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损修复有着非常重要的作用。组织热损伤可刺激功能停止的纤维细胞活化为活跃的成纤维细胞，发动组织修复机制。我们的研究显示，SD大鼠皮肤受D980nm波长激光皮下照射后，实验组与自身对照组相比，可明显观察到成纤维细胞数量增加，胶原纤维含量增加明显，形态上增粗，纤维排列紧密，走向与表皮平行分布，并且更加整齐有规则。由上述激光照射后皮肤结构变化中发现，提示激光可能刺激停止的纤维细胞活化为活跃的成纤维细胞，促使大量成纤维细胞增殖，并且合成了许多胶原蛋白，且其效果与治疗频次有关。

相关实验研究表明TGFβ1可促进成纤维细胞活化增殖，并能刺激成纤维细胞产生胶原蛋白等基质，抑制蛋白酶和基质酶活性，从而使细胞外基质沉积[9]。激光的高热效应可促进真皮胶原新生，当激光照射时，皮肤组织中的水、脂肪、血红蛋白等靶物质吸收光转化成热能，皮肤温度增高，产生损伤发动创伤修复响应，释放TGFβ1等细胞因子(cytokine，CK)，并刺激成纤维细胞活化增殖合成了新胶原。在炎症反应中，对修复免疫系统的整体调节上，TGFβ1还发挥了很重要的作用[14]。较常见与创伤修复有关的CK为转化生长因子β (TGFβ1)，并且它是促进成纤维细胞增殖分裂的重要CK。我们的研究表明在细胞因子方面，大鼠皮肤组织中TGFβ1在经过D980nm激光进行皮下照射治疗后表达增强，并且治疗前后有显著性差异(P<0.01)。其中III组实验组明显高于其余实验组，并且具有明显统计学差异(P<0.01)，提示TGFβ1表达强弱与激光治疗频次有关。由此表明，SD大鼠皮肤受D980nm波长激光皮下照射后能使皮肤胶原纤维含量、成纤维细胞数量增加，TGFβ1表达增强，并且增加及表达量与激光照射频次密切有关，其中3次照射组，大鼠皮肤胶原纤维含量、成纤维细胞数量增加，TGFβ1表达增强显著，定量分析与各组比较，有显著性差异(P<0.01)。这个结果也表明激光治疗频次是影响D980nm波长激光嫩肤效果的一个重要因素，不同的激光治疗频次可以产生不同的机制反应，因此使用合适的激光治疗频次来提高激光作用效果是非常有必要的，并且为后续的研究和临床应用提供实验依据和线索。

但是由于激光紧肤产生机制复杂，有多种细胞、多种信号通路参与，有诸多因素介入影响，不能研究透彻反应机制，只能部分阐明几个重要影响因素。并且因为研究经费以及时间上的限制，对于治疗频次的最优频次，如何达到激光各种治疗参数的最优化，包括波长、能量、脉宽、脉宽频率、治疗间隔时间等，以及如何更好契合激光与其它溶脂紧肤治疗技术的应用，这些问题，有待下一步的研究。

[1]阎晓辉, 于燕, 徐红霞. 上眼睑松垂矫正术的术式选择[J]. 黑龙江医药科学, 2010, 33(1):69-70

[2]宋广斌, 徐学武. 脂肪移植对皮肤质地的改善研究[J]. 黑龙江医药科学, 2011, 34(5):85-86

[3]阿迪米, 孙明, 李善昌. 积雪草皂苷与曲安奈德单独及联合治疗兔耳模型瘢痕的疗效[J]. 黑龙江医药科学, 2014, 37(4):20-22

[4]Manuskiatti W.Efficacy and safety of a carbon-dioxide ablative fractional resurfacing device for treatment of atrophic acne scars in Asians[J]. J Am Acad Dermatol, 2010,63(2):274-283

[5]Weiss ET.Successful treatment of atrophic postoperative and traumatic scarring with carbon dioxide ablative fractional resurfacing:quantitative volumetric scar improvement[J]. Arch Dermatol,2010,146(2):133-140

[6]Alexiades-Armenaka M.Multi-center clinical study and review of fractional ablative CO2 laser resurfacing for the treatment of rhytides,photoaging,scars and striae[J].Journal of Drugs in Dermatology Jdd, 2011,10(4):352-362

[7]许德田, 齐显龙. 口服胶原蛋白水解产物对皮肤的作用[J]. 中国美容医学杂志, 2013, 22(3):410-413

[8]赵娟, 李希宁, 李相军,等. 自体皮肤成纤维细胞与毛发角蛋白复合填充材料在医学美容中的应用[J]. 中国生物制品学杂志, 2012, 25(2):220-223

[9]Wang Z, Zhong H, Yang Z, et al. Exogenous bFGF or TGFβ1 accelerates healing of reconstructed dura by CO2 laser soldering in minipigs[J]. Lasers in Medical Science, 2013, 29(3):1-7

[10]叶媛. 皮肤光老化的光-电疗法[J]. 中国美容医学杂志, 2013, 22(1):112

[11]Muccini J O,Donnell FE.Fuller T Laser treatment of solar elastosis with epithelial preservation[J].Lasers Surg Med,1998,23:121-127

[12]刘亚乐, 葛芹, 李张军,等. 纳米金光热作用对ICR小鼠皮肤光老化保护作用的初步研究[J]. 中华皮肤科杂志, 2015, 48(10):82

[13]孙世杰, 张威, 李懿,等. 半导体激光仪在连续模式下光纤走形间距离对大鼠皮肤紧皱影响的研究[J]. 黑龙江医药科学, 2015, 38(2):96-98

[14]王建峰. 丹参川穹嗪注射液治疗胶原诱导性关节炎大鼠的实验研究[J]. 黑龙江医药科学, 2013, 36(6):23-24

佳木斯大学研究生科技创新项目，编号：YM2016 - 080。

黄信隆(1988 ～)男，浙江温州人，在读硕士研究生。

张威(1963 ～)男，黑龙江哈尔滨人，博士，副主任医师，硕士研究生导师。E - mail:kinwai01@163.com。

R454.2

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1008-0104(2017)04-0074-03

2016-12-04)