中期阿尔茨海默病小鼠模型海马组织Mst1r基因甲基化初探

唐晓琴　李昕　罗斯译

[摘要] 目的 探讨Mst1r基因在中期病程阿尔茨海默病模型（presenilins条件性双基因敲除小鼠，dKO mice）中海马组织的甲基化状态。 方法 选取12月龄雌性dKO mice及同系野生型小鼠各3只，采用二代测序技术（简化表观亚硫氢酸盐测序技术，RRBS）检测其海马组织基因组DNA以获得甲基化异常基因。 结果 RRBS测序成果显示中期AD dKO mice海马组织中Mst1r基因呈超甲基化状态（P<0.05）。 结论 超甲基化的Mst1r基因可能在中期AD dKO mice的病理过程中发挥着一定作用。

[关键词] Mst1r基因；阿尔茨海默病；DNA甲基化；dKO mice

[中图分类号] R749.16 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2017）15-13-03

[Abstract] Objective To explore the methylation status of Mst1r in the hippocampus of the Alzheimer disease （AD） model（presenilins conditional double knockout mice，dKO mice） in the medium term disease. Methods 3 cases of 12 month old female dKO mice and 3 cases of 12 month old syngeneic wild-type mice were selected.The two generation sequencing technology（simplified apparent sulfurous acid salts sequencing technology，RRBS）was used to detect the hippocampus to obtain genomic DNA methylation gene. Results RRBS sequencing showed that the Mst1r gene in the metaphase AD dKO mice hippocampus was hypermethylation（P<0.05）. Conclusion Hypermethylation of the Mst1r gene may play a role in the pathological process of metaphase AD dKO mice.

[Key words] Mst1r gene；Alzheimer disease；DNA Methylation；dKO mice

阿爾茨海默病（Alzheimers disease，AD），作为老年痴呆症的主要形式，是一种具有进行性发展病程的神经系统退行性病变，典型临床症状为进行性记忆力下降、认知功能减退以及神经行为异常[1-3]。其主要病理变化包括由过度磷酸化的tau蛋白异常聚集形成的神经原纤维缠结、β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉积为主形成的老年斑、神经元数目减少以及神经胶质细胞的改变等 [2-4]。但其具体的发病机制仍然尚不明确，因此对其进行早期研究、诊断、预防以及治疗等都有着极其重大的经济与社会意义。本实验通过简化表观亚硫酸氢盐测序技术（reduced representation bisulphite

sequencing，RRBS）初步建立起了12月龄中度神经系统退行性疾病AD模型 dKO mice海马组织中基因组DNA甲基化谱，从而发现了超甲基化的基因Mst1r，这为后续进一步验证以及深入探讨AD的发病机制提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

亲代dKO mice（基因型为Cre+/-，fPS1/fPS1，PS2-/-）由美国Ya-Ping Tang教授（Louisiana State University，USA）惠赠，其品系为B6CBAF1，是将小鼠前脑中的presenilin-1（PS1）基因通过Cre/loxP系统进行条件性敲除，所获得的杂合子与将presenilin-2（PS2）基因通过基因打靶技术进行全身性敲除所获得的杂合子杂交获得[5]。子代dKO mice的喂养、传代以及基因型判定方法如我们之前报道[6]所述。实验组：12月龄dKO mice 3只，雌性，平均体重（35.0±2.6）g；对照组：12月龄野生型小鼠3只，雌性，平均体重（37.0±1.8）g。将6只实验小鼠的海马组织进行RRBS测序。

1.2 海马组织的分离与DNA的提取

采用断颈法处死实验小鼠，剪开脑部皮毛并露出头骨，剥离颅骨后露出小鼠全脑组织，分离全脑组织后将其转移到置于冰袋上的无菌平皿中，快速分离出海马组织并将其放入冻存管中，于液氮中冷冻30～60min后转移至-80℃冰箱中储存备用。海马组织基因组DNA的提取采用天根生化科技有限公司的 TIANamp DNA提取试剂盒（货号DP304），同时通过紫外分光光度计以及0.8%琼脂糖凝胶电泳（100V，40min）分析DNA样本的纯度与浓度。

1.3 RRBS测序与数据分析

甲基化谱RRBS测序由杭州联川生物技术有限公司进行（测序仪Illumina HiSeq 2500），测序文库的构建如Brant JO等[7]所述。测序完成后，在NGSQCToolkit_v2.3软件中过滤掉测序数据5%以上碱基质量数低于30的序列，再利用Bismark（vO.7.4）、edgeR等相关生物软件对比分析过滤后的测序数据与小鼠参考基因组序列，筛选出异常甲基化基因，如我们报道[4]所述。筛选标注为P<0.05。

2 结果

2.1 海马基因组DNA的质量

经紫外分光光度计测定，海马组织基因组DNA样品显示：DNA浓度集中在100～140ng/μL，OD260/280≥1.8。见表1。经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测（100V，40min）显示：DNA样本位于凝胶加样孔附近，电泳条带清晰完整，满足RRBS测序要求，见图1。

2.2 Mst1r基因甲基化筛选结果

运用软件Bismark（vO.7.4）将测序数据比对到小鼠参考基因组序列上，筛选出Mst1r基因呈超甲基化状态。Mst1r基因位于第九号染色体外显子，起始位点为107917199，终止位点为107917365。根据测序结果，在edgeR软件中进行基因差异表达分析，得到甲基化异常基因Mst1r（P<0.05）。见表2。

3 讨论

流行病学调查显示，2016年全世界有AD患者4700万人，估计到2050年将达到1.31亿人，2000 ～ 2013年死于中风、心脏病和前列腺癌的数量分别减少了23%、14%和11%，而死于AD的数量增长了71%[8]。由于人脑组织获得困难，因此利用动物模型研究AD的表观遗传机制尤为重要。目前已经证明dKO mice这种动物模型与AD样神经系统退行性疾病表现相似，如认知功能下降、学习记忆能力丧失、大脑皮质与海马萎缩、严重神经元凋亡、侧脑室与第三脑室扩大、神经胶质过多症以及神经元内tau蛋白的过度磷酸化等[3，6]。该动物模型易于喂养和繁殖，2月龄即表现出轻微记忆损害，7～9月龄时皮质与海马神经元丢失分别达24%和8%，皮质体积减少35%，侧脑室开始扩大[3，9]；12月龄时皮质与海马萎缩更加明显，侧脑室与第三脑室明显扩大，表现出中期AD的表型 [3]。本课题组通过二代测序技術以及相关生物软件对比分析12月龄dKO mice与对照组小鼠海马组织基因组DNA甲基化分布状况，发现了存在于第九号染色体外显子的Mst1r基因呈超甲基化状态。

Mst1r（macrophage stimulating 1 receptor）基因包含20个外显子，其染色体定位于3p21.3，主要转录翻译产物是由40 kD的α链与145 kD的β链组成的185 kD异二聚体。巨噬细胞刺激蛋白（MSP）是Mst1r及其同源基因STK、SEA的配体，是一种肝脏合成的具备免疫调节活性的糖蛋白 [10-11]。研究发现激活Mst1r基因可引发上皮细胞的分化、增殖、迁移及间质的侵袭，表明Mst1r基因可能与人类的一些上皮源性肿瘤相关。如在乳腺癌和肺癌中发现Mst1r基因呈高水平表达；在结直肠癌中发现Mst1r基因过度表达及剪切体变异[11-12]。Fleischer T等[13]发现在乳腺癌中Mst1r基因启动子区域甲基化水平与基因表达呈负相关；姚雨江等[14]研究发现Mst1r基因的单核苷酸多态性（SNPs）与结直肠癌淋巴结转移有关；Angeloni D等[15]通过研究Mst1r基因近端启动子的甲基化状态，发现在乳腺癌、宫颈癌、非小细胞肺癌中Mst1r基因呈去甲基化状态；Dai W等[16]研究发现Mst1r基因是鼻咽癌的易感基因，在鼻咽癌中存在Mst1r基因突变和超甲基化。目前国内外尚未有该基因在AD表观遗传机制中的研究报道，本实验通过RRBS测序发现异常甲基化基因Mst1r呈超甲基化状态，初步提示超甲基化的Mst1r基因可能在中期AD dKO mice的病理过程中发挥着一定作用。

在后续的研究中，我们将进一步增加样本量，并运用单基因甲基化测序（BSP）、甲基化特异性PCR、RT-PCR、免疫印迹 （Western blotting）及免疫组织化学技术等方法进行验证，同时对比分析其在早期和晚期dKO mice海马组织中甲基化状态，为全面了解Mst1r基因在不同AD病程中的甲基化改变情况提供资料。

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（收稿日期：2017-06-04）