近红外漫反射光谱结合相关系数法快速检测制川乌中双酯型生物碱的限量Δ

巩晓宇，陆燕萍，邱凤邹，陈秋燕

(深圳市龙岗区人民医院药剂科，广东 深圳 518172)

近红外漫反射光谱结合相关系数法快速检测制川乌中双酯型生物碱的限量Δ

巩晓宇*，陆燕萍#，邱凤邹，陈秋燕

(深圳市龙岗区人民医院药剂科，广东 深圳 518172)

目的：建立快速检测制川乌中双酯型生物碱限量的近红外漫反射光谱结合相关系数法。方法：选择制川乌、生川乌，分析双酯型生物碱的近红外特征区间，同时测定每批次样品中双酯型生物碱的含量，采用OPUS软件中相关系数法分析每批次样品与生川乌的相关系数，确定方法阈值。结果：炮制充分的样品，相关系数均≤25%；未炮制充分的样品，相关系数均为60%～70%。当定义阈值为40%时，能准确地对样品进行初筛。结论：近红外漫反射光谱结合相关系数法可以对制川乌样品中双酯型生物碱的限量进行初筛，用于该类药品的质量控制，同时可以应用于药品监管机构进行快速筛查和监督抽样。

制川乌； 近红外漫反射光谱； 相关系数法； 双酯型生物碱

制川乌是将川乌用水浸泡至内无干心，取出，加水煮沸4～6 h(或蒸6～8 h)，切开内无白心，口尝微有麻舌感时，切片，干燥，即得。炮制主要是降低生品中单酯型生物碱(苯甲酰新乌头原碱、 苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱)和双酯型生物碱(新乌头碱、次乌头碱、乌头碱)的含量，以达到减毒的目的。《中华人民共和国药典》(2015年版)中采用高效液相色谱法对制川乌中双酯型生物碱的限量进行了规定[1]，但该方法专业性强，操作过程十分麻烦，不利于对炮制过程进行快速准确的分析，在医院购进品种的检测和质量控制上有局限性，使制川乌在临床上的应用存在很大的安全风险。近红外漫反射光谱能在不破坏样品的情况下，综合反映药品的工艺、组成信息[2]，在药物快速检测中优势明显，对植物、动物类药材也有很好的适用性[3]。相关系数法是近红外分析中常用的方法之一，通过比较未知样品光谱与已知标准物质光谱之间的相似系数来分析待测样品的性质。通过设定合理的阈值，能准确快速判断样品中相关成分的含量是否符合要求，适用于限量检测[4]。本研究建立了快速检测制川乌中双酯型生物碱限量的近红外漫反射光谱结合相关系数法，现报告如下。

1 材料

1.1 仪器

MATRIX-F型近红外光谱仪(德国Bruker公司)，配有光纤探头测样附件、铟镓砷检测器、OPUS 7.0光谱分析软件；Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；HANGPING FA2004型分析天平(上海天平仪器厂)。

1.2 样品与试剂

共收集18个批次制川乌样品(其中5个批次用于方法的验证)，1个批次生川乌作为参比对照物，见表1。乙腈、甲醇为色谱纯；水为纯化水；四氢呋喃为分析纯；新乌头碱、次乌头碱、乌头碱对照药材购于中国药品生物制品检定所(批号分别为110799-200404、110798-200404、110720-200410)。

表1 18个批次制川乌样品、1个批次生川乌信息表Tab 1 Sample information of 18 batches of radix aconitum preparata and 1 batch of radix aconitum

2 方法与结果

2.1 相关系数法原理

相关系数(r)为两张光谱的协方差(Cov)除以两张光谱标准偏差(σ)的乘积，即r=Cov[y1(k)，y2(k)]/(σy1·σy2)。其中，r的取值范围为-1～1，如果-1≤r≤0，则将其表示为0%；如果0

2.2 样品近红外漫反射光谱采集及特征谱段的选择

将样品粉碎，过三号筛(50目)后置于样品瓶中，将近红外光纤探头与样品紧密接触，扫描区间12 000～4 000 cm-1，波数间隔8 cm-1，累积次数32次，每批次样品测量3次，取平均光谱，背景光谱每小时重新校正1次，样品光谱见图1(A)。然后取生川乌粉末，分别加入混合对照品溶液0.5、1.0、2.0 ml，测定近红外光谱，见图1(B)。实验发现，在双酯型生物碱混合对照物光谱上(图谱经矢量归一化处理)，在5 600～6 000 cm-1波数范围内，浓度与光谱有明显的相关性(见图2)，故选择此谱段作为相关系数法分析的特征谱段，其他区域有一定的相关性，但有植物基底的干扰，不合适作为特征区间。

A.样品； B.双酯型生物碱混合对照物A.Sample； B.Diester-type alkaloids hybrid control图1 样品与双酯型生物碱混合对照物的近红外光谱Fig 1 Near-infrared spectroscopy of samples and diester-type alkaloid hybrid contro

图2 双酯型生物碱混合对照光谱特征Fig 2 Spectral characteristics of diester-type alkaloids hybrid control

2.3 样品中双酯型生物碱限量测定及相关系数法阈值的确定

首先测定每批次样品中双酯型生物碱的总含量，然后以生川乌为对照，在选定的特征谱段下，比较每个样品与生川乌样品近红外光谱的相似系数，根据《中华人民共和国药典》(2015年版)规定的限量值(不得超过0.040%)，得到相关系数的阈值，从而确定方法的阈值。

2.3.1 色谱条件：安捷伦色谱柱(XDB-C18)(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相A为乙腈-四氢呋喃(V∶V=25 ∶15)，流动相B为0.1 mol/L醋酸铵溶液(每1 000 ml加冰醋酸0.5 ml)，进行梯度洗脱(见表2)；流速为1 ml/min；检测波长为235 nm。

表2 梯度洗脱流程Tab 2 Mobile phase gradients

2.3.2 对照品溶液的制备：精密称取乌头碱对照品0.6 mg、次乌头碱对照品1.7 mg、新乌头碱对照品1.7 mg，置于10 ml容量瓶中，加异丙醇-三氯甲烷(V∶V=1 ∶1)混合溶液定容至刻度(其中每1 ml含乌头碱60 μg、次乌头碱和新乌头碱各0.17 mg)。

2.3.3 供试品溶液的制备：取本品粉末(过三号筛)约2 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加氨试液3 ml，精密加入异丙醇-乙酸乙酯(V∶V=1∶1)混合溶液50 ml，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用异丙醇-乙酸乙酯(V∶V=1∶1)补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 min，40 ℃下减压回收溶剂至干，残渣加入异丙醇-三氯甲烷(V∶V=1∶1)混合溶液3 ml溶解，滤过，取续滤液，即得。

2.3.4 相关系数及阈值的确定：吸取上述2种溶液，按高效液相色谱法测定；同时对测得的光谱，选择OPUS软件中相关系数方法，以生川乌光谱为参照，分别计算相关系数，各批次样品中双酯型生物碱的含量及相关系数见表3。以总双酯型生物碱和相关系数作图，结果显示，相关系数与总双酯型生物碱的含量并不呈线性关系(见图3)，大致可以用多项式拟合：y=929.42x3-301.77x2+32.411x-0.169 3，其中x表示样品中双酯型生物碱的含量，y表示相关系数。由图3可见，炮制充分的制川乌与生川乌的相关系数均≤25%，总双酯型生物碱含量在0.040%的限量值时，相关系数大致在60%～70%，考虑到实际测量中的偏差，可以适当提高预警值，便于完全涵盖不合格的范围，故定义阈值为40%，即当待测样品与生川乌标准对照物近红外光谱相关系数>40%时，提示炮制不充分，双酯型生物碱含量可能高于规定的限量。

表3 样品中双酯型生物碱的测定结果及相关系数Tab 3 Determination of diester-type alkaloids in samples and correlation coefficients

注：“—”表示未检出
Note：“—” indicates not detected

图3 相关系数与总双酯型生物碱含量限量的对应关系图Fig 3 Correspondence graph of correlation coefficient and content limit of diester-type alkaloids

2.4 方法的验证与应用

对所建立的近红外相关系数检测制川乌中双酯型生物碱限量的方法进行了初步的验证，即对医院新购进的制川乌样品按照《中华人民共和国药典》(2015年版)标准进行限量检查，同时采用近红外相关系数法预测，结果显示，一致性良好，见表4。

表4 方法的验证结果Tab 4 Verify results of method

注：“—”表示低于定量限，未检出
Note: “—” stands for below the quantitative value,not detected

3 讨论

近红外光谱法具有快速、无损、无污染、无试剂消耗的优点，能综合反映样本的物质组成信息，可以很好地应用于药品的快速检测[5-9]。通过分析制川乌样品的近红外漫反射光谱特征，选择特征谱段，采用相关系数法，能快速预测样品中双酯型生物碱是否符合《中华人民共和国药典》(2015年版)的规定，对于限量检测提供了很好的研究思路。

相关系数法建立的模型，不同于定量分析，相关系数与含量大小不是简单的线性关系，相关系数建立的模型并不能准确给出样品中双酯型生物碱的含量值[10]。方法给出的阈值，反映的是样品炮制程度的指标，是一个初步的筛查方法，具体的限量值还需要通过法定检验得出。

制川乌样品与生川乌参照物的相关系数，不仅与样品中双酯型生物碱的含量对应，与样品炮制过程中整体变化也密切相关。准确地说，相关系数的变化，是炮制过程中一系列化学变化和物理变化的综合结果反映，双酯型生物碱是其中的指标之一。相关系数法对限量检测的判断，相对于单纯的含量测定更有实际意义，同时，以上研究也提供了限量检查的新思路。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：39-40.

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[3]吴晓毅，巢志茂，孙文，等.基于近红外光谱技术对硫磺熏蒸白芷的定性鉴别和定量研究[J].中国中药杂志，2014，39(10)：1863.

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Rapid Determination of Diester-type Alkaloids in Radix Aconiti Preparata by Near Infrared Correlation Coefficient MethodΔ

GONG Xiaoyu,LU Yanping,QIU Fengzou,CHEN Qiuyan

(Dept.of Pharmacy,People’s Hospital of Shenzhen Longgang District,Guangdong Shenzhen 518172,China)

OBJECTIVE: To establish rapid identification on biogerm limit of diester-type alkaloids in radix aconiti preparata by near infrared diffuse spectroscopy combined with correlation coefficient method. METHODS: Samples of radix aconitum preparata and radix aconitum were selected to analyze the near-infrared characteristic range of diester-type alkaloids. The content of diester-type alkaloids in each batch was also determined. The correlation coefficient method was used to analyze the correlation coefficient between samples of each batch and standard control of radix aconiti,and the method threshold was determined. RESULTS: The correlation coefficient of fully processed samples were ≤25%; yet the correlation coefficient of not fully processed samples were 60%-70%. Samples could be accurately screened when the defined thresholds were set at 40%. CONCLUSIONS: Near-infrared diffuse reflectance spectroscopy combined with correlation coefficient method can be used to determine the limit of diester-type alkaloids in radix aconiti preparata for the quality control of drugs purchased in the hospital. Meanwhile,the method can be applied to screening and supervision of sampling in drug regulatory agencies.

Radix aconiti preparata; Near infrared diffuse reflection spectroscopy; Correlation coefficient method; Diester type alkaloids

深圳市龙岗区科技发展资金医疗卫生(扶持类)项目(No.YLWS20150514153303078)

R927

A

1672-2124(2017)08-1036-03

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.08.011

2017-04-06)

*主管中药师。研究方向：中药资源与鉴定。E-mail：xiaoyu123126@163.com

#通信作者：主任中药师。研究方向：中药鉴定与中药炮制。E-mail：luyanp317@163.com