枸杞多糖对中波紫外线辐射后角质形成细胞炎症因子表达的影响

张琛　杨亚加　杨娥

[摘要] 目的 研究青海柴达木枸杞多糖（LBP）对中波紫外线（UVB）辐射后人永生化角质形成细胞（HaCaT细胞）白细胞介素1（IL-1）和白细胞介素6（IL-6）表达的影响。 方法 将体外培养的HaCaT细胞随机分成5组：空白对照组、UVB辐射组、低剂量枸杞多糖组、中剂量枸杞多糖组、高剂量枸杞多糖组，空白对照组不进行任何处理，UVB辐射组（30 mJ/cm2照射40 min），低剂量枸杞多糖组（0.5 mg/mL，30 mJ/cm2照射40 min），中剂量枸杞多糖组（1 mg/mL，30 mJ/cm2照射40 min），高剂量枸杞多糖组（2 mg/mL，30 mJ/cm2照射40 min），照射前枸杞多糖预处理12 h，酶联免疫吸附测定法（ELISA法）检测各组细胞及上清中IL-1和IL-6的水平。 结果 与空白对照组比较，UVB辐射组细胞中IL-1的水平无明显变化（P > 0.05），IL-6的水平明显增高（P < 0.05）；上清中IL-1、IL-6水平明显提高（P < 0.05）。与UVB辐射组比较，低中高枸杞多糖组无论是细胞中还是上清中IL-1、IL-6水平都明显降低（P < 0.05）。 结论 青海柴达木枸杞多糖可降低UVB辐射后HaCaT细胞中炎症因子的合成及分泌，减轻紫外线辐射后引起的皮肤损伤。

[关键词] 枸杞多糖；人永生化角质形成细胞；中波紫外线辐射；白细胞介素1；白细胞介素6

[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）07（a）-0020-04

[Abstract] Objective To study the effects of the Qinghai Tsaidam Basin Lyciumbarbarum polysaccharide（LBP） on the level of interleukin1 （IL-1） and interleukin6 （IL-6） in cultured human immortalized keratinocytes （HaCaT cells） after ultraviolet （UVB） irradiation. Methods HaCaT cells were cultured in vitro and randomly divided into five groups： control group， UVB radiation group （30 mJ/cm2， radiation 40 min）， LBP low dose group （0.5 mg/mL， 30 mJ/cm2，radiation 40 min） ， LBP middle dose group （1 mg/mL， 30 mJ/cm2， radiation 40 min） ， LBP high dose group（2 mg/mL， 30 mJ/cm2， radiation 40 min）. Before 12 h of UVB irradiation， LBP was added into the culture medium. Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was applied to test the effects of LBP on groups of cells and the supernatant of the level of IL-1 and IL-6. Results Compared with the control group， the levels of IL-1 in the cell in the UVB radiation group had no significant change （P > 0.05）， the level of IL-6 in the cell was significantly higher （P < 0.05）. The levels of IL-1 and IL-6 in supernatant were significantly increased （P < 0.05）. Compared with UVB radiation group， LBP group of cells or in the supernatant IL-1 and IL-6 levels were significantly reduced （P < 0.05）. Conclusion Qinghai Tsaidam Basin LBP can reduce synthesis and secretion of inflammatory factors in HaCaT cells after UVB radiation factor， and reduce the skin damage caused after ultraviolet radiation.

[Key words] Lyciumbarbarum polysaccharide； Human immortalized keratinocytes； Ultraviolet radiation； Interleukin 1； Interleukin 6

据报道，反复暴露于紫外线辐射可导致皮肤炎症、色素沉着、老化、皮肤癌[1]，而中波紫外线（UVB）是引起紫外线辐射导致皮肤光损伤的主要原因，可刺激细胞分泌炎症因子，从而诱发炎性反应并加速细胞损伤。青海柴达木盆地盛产我国最优质的红果枸杞，枸杞多糖是枸杞的主要成分之一，具有增强免疫力，抗肿瘤、抗氧化、清除氧自由基等多方面药理作用[2]，但抗炎作用鲜有报道。本实验通过观察枸杞多糖对UVB辐射后人永生化角质形成细胞（HaCaT细胞）表达白细胞介素1（IL-1）、白细胞介素6（IL-6）的水平，探讨枸杞多糖的抗炎作用机制，为中药的开发探求作用靶點。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

红果枸杞购自于青海德令哈市壹葉香茶行，HaCaT细胞株购自上海中乔新舟生物科技有限公司（批号：ZQ0044），胎牛血清（FBS）购于以色列BI（批号：1706126），PBS缓冲液购于北京索莱宝科技有限公司（批号：20160915），胰酶购于北京索莱宝科技有限公司（批号：20160817），青链霉素混合液购于北京索莱宝科技有限公司（批号：20160309），DMEM培养基购于以色列BI（批号：0033116），IL-1细胞因子ELISA测定试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司（批号：E04620h），IL-6细胞因子ELISA测定试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司（批号：E04638h）。

1.2 实验仪器

二氧化碳培养箱，上海力申科学仪器有限公司；TL20W/12飞利浦紫外线UVB灯管，上海杰图商贸公司；UV-340A UVB辐照度监示器，北京精密仪器商城；冷冻干燥机，ALPHAI-2，德国Christ公司；X-Mark·BIO-RAD酶标仪，BIO-RAD公司；手持匀浆仪，无锡沃信仪器有限公司。

1.3 枸杞多糖的提取

称取干燥后粉碎的红果枸杞粉末50 g，加三氯甲烷∶甲醇（2∶1）500 mL，60℃回流脱脂2次，每次40 min；过滤后滤渣加入80%乙醇500 mL，70℃回流脱小分子糖、苷类物质及黄酮类物质2 h，重复2次；滤渣中加入蒸馏水（液固比20∶1），72℃、200 w超声30 min，重复3次，收集上清液；旋转减压浓缩上清液后加入95%乙醇至浓度为80%，搅拌，4℃过夜[3]。6000×g离心10 min，将沉淀再溶于蒸馏水中，即得粗多糖溶液。加入粗多糖溶液20%体积的Sevag试剂（三氯甲烷∶正丁醇=5∶1），振荡20 min，6000×g离心10 min，收集上清液，重复3次。上清液旋转蒸发浓缩后冷冻干燥至粉末。测定枸杞多糖含量：精密1.0 mL，蒸馏水定容于25 mL容量瓶，吸取1 mL枸杞多糖溶液，在485 nm下测吸光度，由回归方程计算红果枸杞多糖含量为0.8 mg[4-5]。

1.4 HaCaT细胞的培养

HaCaT细胞目前多采用贴壁细胞培养法培养：将HaCaT细胞以含10%胎牛血清（FBS）的DMEM为培养基，接种于培养瓶中，并放入37℃ 5% CO2饱和湿度的培养箱培养，PBS冲洗，0.25%的胰酶消化，DMEM培养液终止消化，当细胞达90%融合时传代，选1～3代细胞进行实验（每次实验选用同一代细胞）。在超净台完成细胞培养等操作。

1.5 细胞光损伤模型的建立及分组

据文献及预实验结果，当处于对数生长期的HaCaT细胞生长至80%～90%融合度时，消化成细胞悬液，并按每孔1.5×104细胞/孔，每孔100 μL细胞悬液接种于6孔板，待细胞贴壁后，弃培养基，用PBS冲洗2遍后，随机分成空白对照组、UVB辐射组、低剂量枸杞多糖组、中剂量枸杞多糖组及高剂量枸杞多糖组，空白对照组不进行任何处理，UVB辐射组以UVB辐射剂量30 mJ/cm2照射细胞40 min，低剂量枸杞多糖组、中剂量枸杞多糖组、高剂量枸杞多糖组分别采用0.5、1、2 mg/mL枸杞多糖预处理12 h后采用相同剂量及相同时间照射，用锡箔纸紧密包住空白对照组后，置于暗处，UVB辐射组和低剂量枸杞多糖组、中剂量枸杞多糖组、高枸杞多糖组的HaCaT细胞打开培养板后置于日光模拟器下照射，照射后弃去培养基，用PBS冲洗2遍，加入完全培养基继续培养24 h[6]。

1.6 IL-1和IL-6含量测定

HaCaT细胞依“1.5”所述处理后，留取细胞上清液待用，后用PBS冲洗HaCaT细胞2遍，0.25%胰酶消化后DMEM培养基终止消化，离心后用PBS稀释成细胞悬液，用手持匀浆仪（无锡沃信仪器有限公司）破坏细胞以放出细胞内成分，采用ELISA法分别进行细胞内及上清液中IL-1和IL-6含量测定。以上测定严格按照ELISA试剂盒说明书进行。所有实验均重复6次。

1.7 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

与空白对照组比较，UVB辐射刺激HaCaT细胞中IL-1的含量变化不明显，IL-6的含量明显升高，上清液中IL-1、IL-6的含量均升高（P < 0.05）。见表1。与UVB辐射组比较，经不同浓度枸杞多糖干预后，各组HaCaT细胞和上清中IL-1和IL-6的水平均明显下降，且随着枸杞多糖浓度的增高，IL-1和IL-6下降的幅度明显增大，呈明显的剂量依赖，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

3 讨论

皮肤衰老是人體衰老的一个重要表现，皮肤老化分为两种。一种是固有性老化，由遗传因素和不可抗拒因素（如重力、机体内分泌、免疫功能随机体衰老的改变）引起的；另一种是由环境因素（如紫外线、吸烟、风吹、接触化学物质等）引起的外源性老化[7]。紫外线是电磁波中波长10～400 nm辐射的总称[8-9]，自然界的紫外线光源是太阳，能穿透臭氧层对正常人皮肤产生红斑等致病作用的主要是UVB，UVB辐射首先可刺激细胞分泌大量炎症因子而诱发炎性反应，产生活性氧基因（ROS）引起一系列的氧化损伤，或是直接损伤DNA导致细胞凋亡[10-11]。目前已经证实，UVB能诱导角质形成细胞产生多种细胞因子，其中IL-1、TNF-α和IL-6功能广泛，不仅能导致皮肤局部的炎性反应，还能引起全身的炎性反应。IL-1可促进角蛋白6（K6）的表达，减少致病菌对角质形成细胞的黏附，是角质形成细胞的诱导因子，可以抵御肿瘤坏死因子相关抗原诱导配体，引起角质形成细胞凋亡。IL-6对皮肤的主要作用在于可以刺激角质形成细胞生长，还能促进IL-1、TNF-α等炎症因子作用。研究表明，IL-1α、IL-6被认为是角质形成细胞-成纤维细胞相互作用环路中的重要中介物质，角质形成细胞通过分泌IL-1α，促进成纤维细胞分泌IL-6，引起成纤维细胞大量基因表达发生变化，再反作用角质形成细胞，促进其增值[12-13]。许多实验研究证实，HaCaT细胞经UVB照射后，IL-1、IL-6等细胞因子的分泌量明显增加，UVB照射后立即加入IL-1、IL-6抗体，则可明显减少细胞肿胀、破碎情况，由此证实了IL-1、IL-6在UVB造成HaCaT细胞损伤中起着至关重要的作用[14-16]。在本实验中，用UVB 30 mJ/cm2的辐射剂量照射HaCaT细胞后24 h后，用ELISA法分别检测细胞及上清液中IL-1、IL-6的含量，结果显示，与空白对照组比较，UVB辐射组细胞中IL-1的水平变化不明显，IL-6的水平明显增高；上清中IL-1、IL-6水平明显提高（P < 0.05），这与之前的文献报道是一致的[17-20]。在2型糖尿病临床治疗过程中，很多患者会出现炎症，C反应蛋白（CRP）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、IL-6等往往存在异常升高的情况，而枸杞多糖通过抑制CRP、TNF-α、IL-6基因表达，下调CRP、TNF-α、IL-6的产生与释放，减轻组织炎症因子的释放，发挥对组织的保护作用[21]。另外，在本实验中，随着枸杞多糖浓度的升高，相应的IL-1、IL-6的含量下降，即在一定范围内，枸杞多糖的浓度越高，IL-1、IL-6的合成和分泌越少。Il-1、Il-6作为重要的生物活性因子，两者之间相互作用，IL-1能增加角质形成细胞中IL-6的合成和释放，紫外线照射角质形成细胞是通过释放介导的IL-1自分泌或旁分泌的方式释放IL-6[22]。

研究表明，柴达木红果枸杞含多种维生素和人体所必需氨基酸，特别是在医用、保健功能中起关键作用的枸杞多糖高达8.3%，枸杞多糖具有调节免疫、清除自由基、抑制肿瘤、延缓衰老、降血脂、降血糖、降血压和抗疲劳等作用[2，23-24]。本实验中，UVB辐射组与低中高枸杞多糖组比较，无论是细胞中还是上清中IL-1、IL-6水平都明显降低（P < 0.05）。从而初步推测，枸杞多糖的光保护作用的保护环节与减少炎症损伤程度、恢复细胞生长增殖能力及减少表皮细胞炎症因子的分泌等有关，但是否还具有抗氧化、减少细胞凋亡等其它途径还需要进一步的探讨。

总而言之，UVB辐射后，HaCaT细胞释放炎症因子增多，枸杞多糖可以显著抑制炎症因子的释放，且结合青海地区地处高海拔、强紫外线和缺氧的地域特色，为青藏高原药材的开发和实际应用提供理论依据，为光损伤的保护机制及新药的开发探求新的作用靶点。

[参考文献]

[1] Iannacone MR，Wang W，Stockwell HG，et al. Patterns and timing of sunlight exposure and risk of basal cell and squamous cell carcinomas of the skin-a case-control study [J]. BMC Cancer，2012，12（1）：1-11.

[2] 冯彦.枸杞多糖药理作用与临床应用[J].中国现代药物应用，2016（6）：278-279.

[3] 孙汉文，刘占锋.枸杞多糖的超声波辅助水提取与分级纯化[J].食品工业科技，2009（3）：230-233.

[4] 胡仲秋，王利，王保玲，等.枸杞多糖提取及消除羟自由基活性研究[J].食品科学，2009，30（24）：93-98.

[5] 吴邓婷.青海枸杞多糖对恶性黑素瘤A375细胞增殖与凋亡的影响[D].西宁：青海大学，2016.

[6] 王丽雯.藏雪莲水提取物减轻UVB辐射后HaCaT细胞凋亡的机制研究[D].西宁：青海大学，2016.

[7] 任琳.皮肤的老化与预防衰老[J].家庭中医药，2017（1）：51-53.

[8] 吴侃.丹参酮IIA抑制UVB照射诱导的HaCaT细胞急性损伤的研究[D].北京：北京协和医学院，2014.

[9] 李杨，安方玉，明海霞，等.黄芪多糖对中波紫外线辐射皮肤角质形成细胞损伤的影响[J].中国中医药信息杂志， 2016，23（5）：44-46.

[10] Pratheeshkumar P，Son YO，Wang X，et al. Cyanidin-3-glucoside inhibits UVB-induced oxidative damage and inflammation by regulating MAP kinase and NF-κB signaling pathways in SKH-1 hairless mice skin [J]. Toxicol Appl Pharmacol，2014，280（1）：127-137.

[11] Martinez RM，Pinhoribeiro FA，Steffen VS，et al. Topical formulation containing naringenin：efficacy against ultraviolet B irradiation-induced skin inflammation and oxidative stress in Mice [J]. PLoS One，2016，11（1）：e0146296.

[12] Divya SP，Wang X，Pratheeshkumar P，et al. Blackberry extract inhibits UVB-induced oxidative damage and inflammation through MAP kinases and NF-κB signaling pathways in SKH-1 mice skin [J]. Toxicol Appl Pharmacol，2015，284（1）：92-99.

[13] Lee JW，Ryu HC，Ng YC，et al. 12（S）-Hydroxyheptadeca-5Z，8E，10E-trienoic acid suppresses UV-induced IL-6 synthesis in keratinocytes，exerting an anti-inflammatory activity[J]. Exp Mol Med，2012，44（6）：378-386.

[14] Kim B，Lee Y，Kim E，et al. The interleukin-1α precursor is biologically active and is likely a key alarmin in the IL-1 family of cytokines [J]. Front Immunol，2013，4（1）：391.

[15] 吕燕红. 枸杞叶总黄酮对UVB照射致无毛小鼠皮肤光损伤的防护作用研究[D].兰州：兰州大学，2016.

[16] 高薇.五味子对UVB辐射人皮肤细胞损伤的保护机制[D].北京：中国农业科学院，2015.

[17] 高扬，易若琨，宋家乐.竹叶总黄酮对UVB诱导HaCaT细胞氧化损伤的保护作用[J]. 南京中医药大学学报，2015（2）：165-169.

[18] 陶冶，张小卿，吴景东.绞股蓝总皂苷含药血清对皮肤光老化HaCaT细胞分泌炎症因子IL-1β、IL-6的影响[J].河南中医，2013，33（1）：48-50.

[19] 王丽新.光敏汤对HaCaT细胞表达IL-10影响研究[J].实用中医药杂志，2015，31（11）：985-987.

[20] 李红光.枸杞多糖在UVB辐射人角质形成细胞氧化损伤中的保护作用[D].太原：山西醫科大学，2014.

[21] 魏燕华，成差群，徐建平.枸杞多糖对2型糖尿病大鼠视网膜炎症因子表达的影响[J].中国药业，2014，23（9）：12-14.

[22] Inoue K，Hosoi J，Denda M. Extracellular ATP has stimulatory effects on the expression and release of IL-6 via purinergic receptors in normal human epidermal keratinocytes [J]. J Invest Dermatol，2007，127（2）：362.

[23] 李洋，马文平，倪志婧.宁夏枸杞体外抗氧化机理研究[J].食品科学，2014，35（1）：79-84.

[24] Concepcion P，Marta M，Yolanda G，et al. Fernblock（polypodiumleucotomos extract）：molecular mechanisms and pleiotropic effects in light-related skin conditions，photoaging and skin cancers，a review [J]. Int J Mol Sci，2016（7）：1026.

（收稿日期：2017-03-31 本文编辑：李岳泽）