不同性状荷叶水提液对脂肪酶活性影响比较

王丽娜++许春++皇盖林++支家华

摘要：目的比较不同性状荷叶的水提液对脂肪酶活性的影响。方法以橄榄油-聚乙烯醇乳化液为底物，加入荷叶水提液反应20 min，用标准氢氧化钠溶液滴定反应生成的脂肪酸，用氢氧化钠消耗的量计算脂肪酶活性。结果不同性状的荷叶样品对脂肪酶活性均有不同程度的抑制作用，试验考察不同产地的七个不同性状荷叶样品对脂肪酶活性的抑制作用发现性状上色浅、较嫩的样品抑制作用较低。结论关于荷叶对脂肪酶抑制作用的研究中，主要集中在经过纯化的生物碱和黄酮类成分，本文直接以水提物为研究对象，通过相对简便和快捷的方法对荷叶的脂肪酶抑制功能进行评价，为荷叶的采收加工、选材利用和开发提供参考。

关键词：荷叶；性状；胰脂肪酶；抑制剂

中图分类号：R284文献标志码：A文章编号：1007-2349（2017）08-0082-02

荷叶（Nelumbinis Folium）为睡莲科植物莲的干燥叶。荷叶作为药食同源中药品种，在药品、保健食品和普通食品的应用中广受青睐。《中国药典》（2015版）一部中共收载了六个配方中使用了荷叶的成方制剂。通过国家食品药品监督管理局数据查询检索，主要原料使用了荷叶的已注册保健食品多达290余个。原料中使用荷叶的普通食品更是品种繁多，以袋泡茶形式居多。

荷叶的功效研究主要集中在减肥、调节血脂、抗氧化等方面[1][2]。研究显示荷叶中的生物碱和黄酮类成分都具有抑制脂肪酶活性的作用。朱晓青等人的研究显示，荷叶粗粉经过石油醚去脂后，用95%乙醇提取，初步纯化后得荷叶生物碱粗提物，通过实验证实其间接改变底物乳化来阻碍底物-酶结合达到抑制作用[3]。霍世欣等研究显示，荷叶粗粉用60%乙醇回流提取，经石油醚脱脂，再用聚酰胺柱色谱分离得到不同部位的黄酮提取物，其中50%乙醇洗脱部位剂对胰脂肪酶的抑制呈非竞争性抑制[4]。目前有关荷叶功效或药理研究多以经过提纯后的大类成分为主，而荷叶在实际的使用中基本都是以水为溶剂进行粗提就直接利用。荷叶饮片的外观性状存在较大出入，因为生长的成熟度不同从青绿色到棕色存在较大差异，针对不同采收季节的荷叶研究其中荷叶碱的含量变化研究显示不同采收期对荷叶生物碱的含量也有较大影响[5]。而对于荷叶水提取液对脂肪酶活性影响分析的研究少见。

1材料与方法

11材料与试剂荷叶饮片分别采购自云南白药集团中药资源有限公司和昆明市官渡区平安药材经营部，产地及形状见表1。试剂聚乙烯醇（AR）、无水乙醇（AR）、盐酸（AR）、脂肪酶（>30000μ/g）、磷酸氢二钠（AR）、磷酸二氢钾（AR）、氢氧化钠（AR）采购自昆明福海达化玻仪器有限公司。

12仪器电热恒温水浴锅（XMTD--4000北京市永光明医疗仪厂）、实验室高剪分散乳化机（上海发孚莱能源技术有限公司，FSL-II）、电子天平（梅特勒）。

13方法

131荷叶水提取液的制备取荷叶饮片，粉碎，精密称取1 g，加纯净水微沸提两次，每次均加50 mL，第一次微沸15 min，第二次微沸10 min，两次滤液和并后定容到50 mL备用。

132脂肪酶活性测定胰脂肪酶催化脂肪分解，生成脂肪酸，以酚酞做指示剂，用标准NaOH溶液滴定生成的脂肪酸，根据所用NaOH的消耗量来计算脂肪酶活力。本实验设计基于腾宏飞等在橄榄油乳化法测定脂肪酶活性的优化研究[6]内容基础上确定。

C17H33COOH+NaOH[FY]C17H33COONa+H2O

脂肪酶活力单位定义：在pH 74，40℃条件下每分钟催化脂肪水解生成1μmol脂肪酸的酶的量，定义为一个酶活力单位。

测定步骤：在100 mL锥形瓶中加入5 mL 0025 mol/L磷酸缓冲液（pH=74）和4 mL聚乙烯醇三油酸甘油酯底物乳化液（4%聚乙烯醇（PVA）溶液中按1：100加入橄榄油乳化制成），置于40℃水浴保温10 min，然后加入1 mL酶液（2 mg/mL），之后再反应15 min，加95%乙醇15 mL终止酶反应。加酚酞2滴，用0025 mol/LNaOH标准溶液滴定至微红色，记录NaOH的消耗体积。

空白实验的酶液在反应终止后加入。通过比较有无抑制剂加入情况下，脂肪酶活力的差异，就可以得到样品对脂肪酶的抑制率。

控制率=[SX（]脂肪酶活力-抑制后脂肪酶活力[]脂肪酶活力[SX）]×100%

133實验方法

1331空白组分别取磷酸盐缓冲溶液4 mL和10%PVA橄榄油乳化液4 mL于100 mL的三角瓶中，在40℃水浴中预热10 min后，计时15 min后，加15 mL95%乙醇终止反应，加1 mL的酶液，加1滴的酚酞，用0025 mol/L氢氧化钠来滴定，记录消耗的体积。

1332对照组分别取磷酸盐缓冲溶液4 mL和10%PVA橄榄油乳化液4 mL于100 mL的三角瓶中，在40℃水浴中预热10 min后，加1 mL的酶液立即计时15 min后，加15 mL95%乙醇终止反应，加1滴的酚酞，用0025 mol/L氢氧化钠来滴定，记录消耗的体积。

1333供试组分别取磷酸盐缓冲溶液3 mL和10%PVA橄榄油乳化液4 mL于100 mL的三角瓶中，再加1 mL的供试液，在37度的水浴锅中预热10 min后，加1 mL的酶液立即计时15 min后，加15 mL95%乙醇终止反应，加1滴的酚酞，用0025 mol/L氢氧化钠来滴定，记录消耗的体积。

2实验结果与分析

21实验结果根据13测定方法平行进行3次试验后取平均值进行脂肪酶活力测定数据。

结果显示，相同产地的不同性状样品对脂肪酶活性的影响程度存在较大差异，本实验条件下，抑制率最高的结果为4727%，最低的结果为1412%；结合样品的外观性状观察，性状上色浅、较嫩的样品对脂肪酶活性的抑制作用低于性状上色深、较老的样品。不同产地的样品之间同样存在差异，但产地差异间没有明显规律。

22结果分析本实验情况下上述7个样品的平均抑制率为3096%。相关研究文献显示荷叶总生物碱在在600ug/ml时达到最大抑制率，为256%[7]。分析本文结果与现有研究结果的差距，主要原因可能与本方法直接采用药材的水提液，没有对色素等杂质进行去除，所以对滴定终点的颜色观察存在一定的影响。

3讨论

目前荷叶作为药用饮片使用遵循的是《中国药典》标准，检验项目有性状、鉴别、水分、总灰分、醇浸出物、荷叶碱含量测定。作为食品原料使用大多遵循的是供销合作行业标准GH/T 1091《代用茶》标准，检验项目有基本要求、感官指标（外观、汤色、香气、滋味）、水分、总灰分及卫生指标，而出厂检验仅规定了感官、水分和净含量。在荷叶的实际使用中多采用水煎煮后再按照剂型要求进行制剂，以荷叶功效为主要目的的应用中仅凭现有的标准很难全面评价荷叶原料的质量/功能水平，所以在荷叶的开发利用环节应充分考虑药效学研究内容。

通过本文实验中云南和湖南两地样品的结果，结合样品的外观性状观察，性状上色浅、较嫩的样品对脂肪酶活性的抑制作用低于性状上色深、较老的样品。说明在荷叶的生长过程中对于脂肪酶具有抑制作用的成分发生着变化或转化，何晓曦等人的研究结果显示，随着生长期的延长，生物碱成分之间可能存在一定的生物转化[5]，所以应结合荷叶总生物碱、荷叶碱、总黄酮等主要成分的情况，以及脂肪酶活性影响的结果才能更好阐释不同性状的荷叶在应用中的优劣势。

本文直接以荷叶的水提液进行试验研究，通过相对简便和快捷的方法评价荷叶对脂肪酶活性影响，希望本文的研究对荷叶的开发利用提供一定的借鉴作用，尤其是在荷叶原料的质量控制，原料的筛选和使用方面，同时也为荷叶的采收加工、选材利用和开发提供有益的参考作用。

参考文献：

[1]涂长春，李晓宇，杨军平，等荷叶生物总碱对肥胖高脂血症大鼠减肥作用的实验研究[J].江西中医学院学报200113（3）：120-121

[2]余以刚，陈海光，曾庆孝荷叶水提物清除自由基的ESR研究[J].中草药200132（8）：693-695

[3]朱晓青，吕敬慈，霍世欣，等荷叶生物碱对胰脂肪酶的抑制作用[J].上海大学学报（自然科学版）200713（2）：85-87，93

[4]霍世欣，周陶忆，司晓晶，等荷叶黄酮化合物对胰脂肪酶抑制作用的研究[J].天然产物研究与开发200820：328-331

[5]何晓曦，孔令提，张泽生，等不同产地和不同采收期荷叶中生物碱的含量变化[J].天然产物研究与开发2013，25：652-655，661

[6]滕宏飞，王丹静，徐青，等橄榄油乳化法测定脂肪酶活性的优化研究[J].食品工业2011（6）：80-83

[7]范婷婷，法鲁克，方芳，等荷叶总生物碱降脂减肥作用的体内外试验[J].浙江大学學报（农业与生命科学版）210339（2）：141-148