麻黄碱对IL-17诱导的人永生化角质形成细胞HaCaT分泌CCL20的影响

蒋燕，郭顺，，邹悦，陈力

(1南京中医药大学第一临床医学院，南京210023；2江苏省中医院)

麻黄碱对IL-17诱导的人永生化角质形成细胞HaCaT分泌CCL20的影响

蒋燕1，郭顺1，2，邹悦1，陈力2

(1南京中医药大学第一临床医学院，南京210023；2江苏省中医院)

目的 观察麻黄碱对IL-17诱导的人永生化角质形成细胞HaCaT分泌CCL20的影响。方法 将HaCaT细胞随机分为6组。A组加不含药物的培养液， B组加含20 ng/mL IL-17的培养液，C、D、E分别加含20 ng/mL IL-17联合800、1 200、1 600 μg/mL麻黄碱的培养液，F组加含20 ng/mL IL-17联合50 μg/mL MTX的培养液。培养36 h后，采用ELISA法测定细胞上清液CCL20，采用RT-PCR法测定细胞中的CCL20 mRNA。结果 A、B、C、D、E、F组HaCaT细胞上清液CCL20水平分别为(97.72±1.86)、(159.43±7.09)、(147.05±2.25)、(138.60±8.04)、(126.66±7.04)、(114.39±3.90)pg/mL，HaCaT细胞CCL20 mRNA相对表达量分别为0.91±0.08、7.22±0.32、4.95±0.33、2.79±0.19、1.79±0.49、1.80±0.47；B、C、D、E、F组均高于A组(P均<0.05)，D、E、F组均低于B组(P均<0.05)，C、D组均低于F组(P均<0.05)。结论 麻黄碱能有效抑制IL-17诱导的HaCaT细胞分泌CCL20，为麻黄治疗银屑病提供一定的理论依据。

麻黄碱；趋化因子；CCL20；白细胞介素17；银屑病；人永生化角质形成细胞

银屑病是一种由T细胞介导的持续存在的慢性、炎症性疾病，其主要表现是角质形成细胞的异常分化和增殖。Th17细胞是一类T细胞，其标志性细胞因子IL-17 具有强大的致炎性，在银屑病的发生发展过程中有重要作用[1，2]。CCL20又称为巨噬细胞炎性蛋白-3α( MIP-3α)，是CC类趋化因子之一，在IL-17的诱导下表达明显增加[3～5]；其也可诱导Th17细胞增殖和活化，并募集炎性因子进入皮损区,导致银屑病的发生[4，5]。传统中医认为银屑病多采用清热凉血法，现代中医创新地提出汗法治疗银屑病亦可取得良好效果[6，7]。麻黄作为发汗药之首，具有通腠理、解肌功效。麻黄碱是麻黄的主要成分，具有一定的发汗作用。2016年5～10月，我们以麻黄碱作为干预药物，观察其对IL-17介导的人永生化角质形成细胞HaCaT分泌CCL20的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及设备 人永生化的角质形成细胞HaCaT购于南京凯基生物有限公司，高糖DMEM、胎牛血清、0.25%胰酶/EDTA、青霉素/链霉素双抗溶液、DMSO购于美国Gibco公司；重组IL-17购于美国PeproTech公司，重组细胞因子溶解稀释套装购于杭州联科生物技术有限公司。盐酸麻黄碱购于中国食品药品检定研究院，甲氨蝶呤注射液(MTX)购于江苏恒瑞医药股份有限公司。ELISA试剂盒购于美国R&D公司，TRIzol购于美国Invitrogen公司，逆转录及SYBR Premix Ex TaqTMⅡ荧光定量PCR试剂盒均购于大连宝生物工程有限公司。倒置相差显微镜为日本Olympus公司产品，细胞培养箱为美国Thermo公司产品，荧光定量PCR仪、酶标仪为美国Bio-Rad公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 HaCaT细胞培养 HaCaT细胞置于高糖DMEM培养基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素)中，于5% CO2、恒温、37 ℃培养箱培养。

1.2.2 药物溶液制备 麻黄碱先高温灭菌后用PBS(pH 7.2～7.4)溶解成10 mg/mL，母液储存于4 ℃冰箱，临用时用10%血清DMEM稀释成各浓度加入孔中。MTX以高温灭菌后用PBS(pH 7.2～7.4)稀释成50 μg/mL待用，储存于4 ℃冰箱。

1.2.3 HaCaT细胞上清液中CCL20水平检测 采ELISA法。取对数生长期的HaCaT细胞，常规消化后按5×105/孔种植于6孔板，置于37 ℃、5% CO2恒温孵箱中。24 h后观察铺板均匀、生长状态良好后，将细胞随机分为6组。A组加不含药物的培养液2 mL， B组加含20 ng/mL IL-17的培养液2 mL，C、D、E、分别加含20 ng/mL IL-17联合800、1 200、1 600 μg/mL麻黄碱的培养液2 mL，F组加含20 ng/mL IL-17联合50 μg/mL MTX的培养液2 mL。培养36 h后收集上清液，以2 000～3 000 r/min离心20 min，收集上清。用PBS(pH 7.2～7.4)稀释细胞，调整细胞密度到1×106/mL。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成分。以2 000～3 000 r/min离心20 min，收集上清。每组设3个复孔，根据ELISA试剂盒说明进行，操作实验完成后用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔光密度(OD值)；根据制作的标准曲线，采用间接法读取各样品的CCL20水平。

1.2.4 HaCaT细胞CCL20 mRNA表达检测 采用RT-PCR法。取对数生长期的HaCaT细胞，常规消化后按35×105/孔种植于直径6 mm小皿中，置于37 ℃、5% CO2恒温孵箱中。24 h后观察铺板均匀、生长状态良好后，细胞分组与用药同1.2.3，培养36 h。①HaCaT细胞总RNA提取：采用TRIzol法。小皿中加入4 ℃的TRIzol 1 mL，然后转移至1.5 mL离心管中，在室温下放置5 min，使得核酸蛋白复合物完全分离；然后加入0.2 mL氯仿，盖紧离心管管盖，用手上下振荡15 s，溶液呈乳白状，无分层现象；室温静置3 min后，4 ℃下以12 000 r/min离心15 min；取出离心管，样品分为无色的上清水相、中间的白色层及粉红色的下层有机相。小心吸取无色上清水相，移至另一离心管；向得到的上清水相加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，室温静置10 min；4 ℃下以12 000 r/min离心10 min，小心去除上清；缓慢沿管壁加入75%乙醇(用DEPC处理过的水配制)1 mL，轻轻混匀。4 ℃下以12 000 r/min离心10min，小心吸尽上清；室温干燥沉淀5 min，加入30～50 μL的无RNase水溶解RNA沉淀，待完全溶解后于-70 ℃保存。②RNA纯度测定及定量：取RNA样品，用Buffer稀释100倍，测定样品在260 nm和280 nm的OD值确定RNA的质量。计算公式：RNA浓度=OD260×稀释倍数×0.04 μg/μL。比色皿光径1 cm，OD260/OD280在1.8～2.1可进行下一步的实验。③cDNA的合成：反应液的配制按说明书进行，反应体系为20 μL。反应条件为37 ℃ 15 min (反转录反应) ，85 ℃ 5 s(反转录酶失活反应) ，合成第一链cDNA。④荧光实时定量PCR反应：引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。CCL20上游引物为5′-ACCTCTGCGGCGAATCAGAA-3′,下游引物为5′- GATAGCATTGATGTCACAGCCTTCATT-3′，扩增片段为134 bp；内参照β-action上游引物为 5′-TGGTATCGTGGAAGGACTCA-3′，下游引物为5′-CCAGTAGAGGCAGGGATGAT-3′，扩增片段为132 bp。RT-PCR反应液的配制按说明书进行，反应体系为20 μL 。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，循环40次，实验结果采用2-ΔΔCT计算，以CCL20 与β-actin 的比值表示其相对表达量。

2 结果

2.1 各组HaCaT 细胞上清液CCL20水平比较 A、B、C、D、E、F组HaCaT细胞上清液CCL20水平分别为(97.72±1.86)、(159.43±7.09)、(147.05±2.25)、(138.60±8.04)、(126.66±7.04)、(114.39±3.90)pg/mL，B、C、D、E、F组HaCaT细胞上清液CCL20水平均高于A组(P均<0.05)，D、E、F组HaCaT细胞上清液CCL20水平均低于B组(P均<0.05)，C、D组HaCaT细胞上清液CCL20水平均低于F组(P均<0.05)。

2.2 各组HaCaT细胞CCL20 mRNA表达比较 A、B、C、D、E、F组HaCaT细胞CCL20 mRNA相对表达量分别为0.91±0.08、7.22±0.32、4.95±0.33、2.79±0.19、1.79±0.49、1.80±0.47，B、C、D、E、F组HaCaT细胞CCL20 mRNA相对表达量均高于A组(P均<0.05)，D、E、F组HaCaT细胞中CCL20 mRNA相对表达量均低于B组(P均<0.05)，C、D组HaCaT细胞CCL20 mRNA相对表达量均低于F组(P均<0.05)。

3 讨论

Th17细胞作为影响银屑病发生发展的重要T细胞广受关注，其向皮损迁移浸润是银屑病最先发生的过程[8]。IL-17是Th17细胞特异产生的细胞因子，具有强大的致炎效应，也可诱导角质形成细胞产生各种趋化因子。CCL20是IL-17诱导分泌的重要趋化因子，其特异性受体CCR6多表达于Th17细胞中的CD4+效应T细胞[9]。CCL20与CCR6的惟一选择性保证了CCR6阳性细胞即Th17细胞准确迁移定位至皮损部位[10]。CCL20特异性募集Th17细胞，也可诱导其增殖活化分泌大量促炎因子IL-17、IL-22、TNF-α等；这些炎性因子也可以被CCL20募集至皮损部位，并且可以刺激角质细胞异常增殖并释放更多细胞因子,以活化T细胞[4，5，11]。活化后的T细胞及角质形成细胞分泌的细胞因子，可通过影响增殖及凋亡调控基因的表达，再次影响角质细胞的增生，形成恶性循环，最终导致银屑病的发生发展[1]。研究表明，IL-17显著增加CCL20的表达, 具有剂量和时间依赖性[5]。在正常角质形成细胞中CCL20低水平表达，而CCL20在银屑病皮损中呈高表达，皮损越严重表达程度越高[5，11]。本次实验以IL-17作为诱导因子介导永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)分泌CCL20模拟银屑病体外实验简易模型。现代医家总结前人经验认为银屑病常由“血”论治，常治以清热凉血法。宋坪等[7]提出从“玄府”论治新观点，在治疗上采用“开通玄府法”治疗斑块状银屑病，常用药物麻黄、桂枝等，治疗银屑病也取得一定成效。我们在前期研究中已证实，单药麻黄可以拮抗小鼠银屑病样模型的发生[12]。麻黄碱作为麻黄的主要成分，分子量较小，易溶于水、乙醇等溶剂，较为稳定，并且有研究表明其具有较强发汗作用[13]。本研究将麻黄碱溶于pH适宜的PBS中，并且分成800、1 200、1 600 μg/mL的浓度分别干预IL-17诱导的HaCaT细胞，为“汗法”治疗银屑病的体外实验提供一定的实验基础。MTX在临床运用治疗银屑病得到广泛应用，取得较好疗效[14]。其药理学作用主要是竞争性抑制四氢叶酸在胸腺嘧啶合成过程中传递甲基的作用，以阻止细胞周期中DNA的合成，可以影响银屑病中角质细胞异常增殖达到治疗目的；也有研究发现，MTX可以抑制体内淋巴细胞的增殖活化[15]；另有部分学者研究发现，其可能在抑制T细胞活化并且抑制活化后趋化因子的生成以阻断银屑病恶性循环的免疫效应有重要作用[16，17]。因此，本次实验参考以往文献[18]及前期实验以50 μg/mL MTX干预IL-17诱导的HaCaT细胞作为阳性参照组。

本次实验运用ELISA测定麻黄碱、MTX干预IL-17诱导的细胞分泌CCL20，结果表明IL-17能够促进HaCaT细胞分泌CCL20，麻黄碱能依赖浓度抑制这一效应，MTX也能达到明显地抑制效果，且MTX的抑制效应比低、中浓度的麻黄碱强。RT-PCR检测结果与此相一致：IL-17能够提升HaCaT细胞的mRNA表达水平，麻黄碱随着浓度的增加抑制效应更强；MTX能够明显地抑制其表达水平，并且比低、中浓度麻黄碱平均表达水平低。此结果表明，IL-17能够明显提高HaCaT细胞分泌CCL20的能力，MTX作为临床疗效确切的药品能够明显抑制其分泌能力，与既往研究相符[18]。低浓度与中浓度的麻黄碱虽然没有MTX的抑制效应强，但是从三组不同浓度麻黄碱的比较来看，随着麻黄碱的浓度升高，HaCaT细胞分泌CCL20的水平、CCL20 mRNA相对表达量越来越低。这表明麻黄碱能够抑制IL-17诱导HaCaT细胞分泌CCL20，提示麻黄碱可能在抑制银屑病活化Th17细胞及其分泌趋化分子这一环节发挥作用，具体机制还需进一步研究。本实验为麻黄组成方有效治疗银屑病提供一定实验基础，为“汗法”治疗银屑病提供理论基础。

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Effect of ephedrine on CCL20 secretion of IL-17-induced immortalized human keratinocytes (HaCaT)

JIANGYan1,GUOShun,ZOUYue,CHENLi

(1FirstClinicalMedicalCollegeofNanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China)

Objective To observe the effect of ephedrine on CCL20 secretion of IL-17-induced immortalized human keratinocytes (HaCaT).Methods HaCaT cells were randomly divided into 6 groups.Cells in the group A were only treated by DMEM. Cells in the group B were treated with 20 ng/mL IL-17 nutrient solution. Cells in the groups C, D and E were treated with 800, 1 200 and 1 600 μg/mL ephedrine medium including 20 ng/mL IL-17. Cells in the group F were treated with 20 ng/mL IL-17 combined with 50 μg/mL MTX culture medium. After 36 h, ELISA was performed to determine the expression of CCL20 protein. RT-PCR was used to assess the expression of CCL20 mRNA. Results The expression levels of CCL20 protein in the cultural supernatant of HaCaT cells of groups A, B, C, D, E and F were (97.72±1.86), (159.43±7.09), (147.05±2.25), (138.60±8.04), (126.66±7.04), (114.39±3.90) pg/mL, respectively. The relative CCL20 mRNA expression in HaCaT cells of groups A, B, C, D, E, F were 0.91±0.08, 7.22±0.32, 4.95±0.33, 2.79±0.19, 1.79±0.49, 1.80±0.47, respectively. Groups B, C, D, E and F were higher than group A (allP<0.05); groups D, E, F were lower than group B (allP<0.05); groups C and D were lower than group F (all P<0.05).Conclusion Ephedrine can inhibit the CCL20 secretion of IL-17-induced HaCaT cells, and it provides a theoretical basis for the treatment of psoriasis by ephedrine or even diaphoresis.

ephedrine; chemotactic factor; CCL20; interleukin-17; psoriasis; immortalized human keratinocytes

国家自然科学基金资助项目(81603626)；江苏省中医院院级课题(Y14020)。

蒋燕(1990-)，女，硕士研究生，主要研究方向为银屑病。E-mail： jiangyan20088@126.com

陈力(1960-)，女，硕士生导师，教授，主任医师,主要研究方向为痤疮及银屑病等。E-mail： wandyyf@sina.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.10.007

R285.5

A

1002-266X(2017)10-0024-04

2016-11-15)