电刺激影响牛肉成熟过程中嫩度的信号通路分析

沈瑾

摘要 牛肉品质的好坏，最重要的指标是嫩度。介绍了牛肉成熟机制研究进展，包括在牛肉成熟过程中嫩度的影响因素和加快牛肉成熟的技术，讨论了电刺激影响嫩度的分子机理，主要通过糖酵解代谢途径、钙激活中性蛋白酶途径、溶酶体途径、氧化应激途径影响嫩度。电刺激影响牛肉成熟过程中嫩度的信号通路表明，牛肉的嫩度与氧化和凋亡有密不可分的联系。

关键词 牛肉成熟；嫩度；电刺激；信号通路

中图分类号 S879.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）07-0083-04

The Signal Pathway Analysis of Tenderness as a Result of Electrical Stimulation in the Process of Beef Maturation

SHEN Jin （Xintai Agricultural Bureau，Xintai，Shandong 271200）

Abstract Tenderness is an important indicator for evaluation of beef quality.This paper introduces research progress of beef mature mechanism，including the factors affecting meat tenderness and technology accelerating meat mature，discusses the molecular mechanism of tenderness as a result of ES.Meat tenderness is affected mainly by glycolytic metabolic pathway，calpains pathway，lysosomal pathway，oxidative stress pathway as a result of electrical stimulation.The pathways indicate that meat tenderness is closely related to oxidation and apoptosis.

Key words Beef maturation；Tenderness；Electrical stimulation；Signal pathway

肉类产业的发展经历了3个过程。第1个过程主要是为了满足消费者的需求而进行的肉类生产，利用增大畜禽养殖数量的方法来增加肉类的供应量；第2个过程是利用先进的管理技术加快畜禽生长，提高产肉率；第3个过程是聚焦肉类品质的改善，来满足消费者日益增长的肉制品需求。当前，肉类产业正处于第3个过程的初期，科学家们也越来越重视肉类品质改善以及食用安全的研究。

牛肉品质的好坏，最重要的指标是嫩度[1]。大量的试验调查证实，嫩度的优劣可以被消费者分辨出来，而且他们很愿意购买优质牛肉[2]。嫩度直接决定着牛肉食用品质的优劣[3]。美国肉牛协会（NCBA）将研究牛肉嫩度的改善方法和提高嫩度的一致性作为提高牛肉市场份额的重要任务[4-5]。所以，我国牛肉要提高在世界牛肉市场的份额，改变依赖进口优质牛肉的被动局面，必须将改善牛肉嫩度作为核心任务。

1 牛肉成熟机制研究进展

刚屠宰后的热鲜肉具有可接受的嫩度，尸僵期嫩度最差[6]，随着成熟时间的延長嫩度逐渐得到改善[7]，而不同动物品种和个体间成熟的速度和进程并不相同，从而造成肉的最终嫩度极不均一[8]。

1.1 成熟过程中影响肉嫩度的因素

研究表明，结缔组织构成及含量、肌节长度[9]、肌内脂肪含量、骨架蛋白降解程度[10]等方面是成熟过程中影响肉嫩度的主要因素。其中，骨架蛋白是一个关键因素。

肌纤维是构成肌肉的基本结构，是决定肌肉嫩度的关键因素。肌原纤维在I带和Z盘结合处（靠近Z盘的I带上）的断裂，直接与肉的嫩化有关。肌原纤维由多种蛋白构成，骨架蛋白的降解能提高肉的嫩度，前期研究已证实肌联蛋白（Titin）、伴肌动蛋白（Nebulin）、肌钙蛋白T（Troponin-T）、肌间线蛋白（Desmin）等蛋白与嫩度密切相关[11]。

Titin广泛存在于动物的骨骼肌和心肌中，位置位于Z线及M线间，其N未端与Z盘結合，多肽链从I带一直延伸到A带，在I带与粗丝结合伸缩性较强，而在A带伸缩性较弱，因此Titin被称为弹性微丝，具有调节粗丝长度，稳定粗丝，保持肌节完整性的作用。Nebulin的C末端与Z盘结合，使细丝和Z盘牢固连接，从而稳定细丝的空间稳定性[12]。Desmin为中间丝蛋白[13]，环绕肌原纤维Z线，从而连接相邻肌原纤维[14]。牛宰后储存过程中Desmin被降解[15-16]，整个骨骼肌细胞有序性及完整性[17]被破坏，牛肉嫩度提高[18]。Troponin-T是钙蛋白酶（μ-calpain）的底物，Troponin-T的降解可能是宰后蛋白水解的指标。牛肉中纯化得到的Troponin-T能被μ-calpain降解，产生30 kD的多肽[19]。此外，用蛋白质印迹法免疫印迹试验（western blot）证明，在成熟牛肉中发现的30 kD的多肽是Troponin-T的产物，且宰后时间与2条主要条带30 kD和28 kD的出现密切相关[20]。Troponin-T是介导肌动蛋白-肌球蛋白相互作用的复合物的一部分。宰后肌钙蛋白T的降解，以及在 Ⅰ 带与其他蛋白相互作用的减弱，可能导致中肌原纤维在 Ⅰ 带区域出现断裂，产生肌原纤维的小片化。然而，由于肌钙蛋白T是骨骼肌的基本部分，它在宰后嫩化过程中的作用还有待于进一步研究[21]。

1.2 加快肉品成熟的技术

肉的嫩度主要取决于肌动蛋白（Actin）和肌球蛋白（Myosin）的结合状况、肌纤维中骨架蛋白的完整程度及结缔组织的构成、性质及含量，所有用来提高肉嫩度的方法都与这些蛋白质的变化有关。

1.2.1 基因调控及重组嫩化。目前已经完成了编码钙激活酶（Calpain）和钙激活酶抑制蛋白（Calpaststin）的基因克隆和染色体定位，利用反义技术等基因调控手段，可以增加处在生长发育阶段钙激活酶抑制蛋白的含量，降低钙激活酶的活性，降低肌肉中蛋白质代谢速度，提高瘦肉产量。在动物屠宰前使用调控手段提高肌肉中钙激活酶的含量或降低钙激活酶抑制蛋白含量的方法促进肉的嫩化。

1.2.2 电刺激嫩化。

肉牛屠宰放血后，施以电刺激处理，可以快速降低肉的pH，影响肉的pH/温度窗口和Calpains酶系的活性，从而达到肉快速嫩化的目的[22-23]。

电刺激是指使用特定电压、时间和频率，对屠宰后的胴体进行的操作[24]。电刺激的电流经过神经系统（宰后4～6 min）或者直接使肌膜去极化，从而引起肌肉收缩[25]。在此过程中，糖酵解速率提高约100倍[26]，pH加速降低，肉在较高温度下进入尸僵状态，避免了冷收缩的发生[27]。

电刺激的参数对作用效果有很大的影响，这些参数包括电压、电流、波形、频率、实施时间、电极类型、电极的位置等。

1749年，Benjamin Franklin首次对宰后火鸡进行电刺激，然而直到1951年，美国人Harsham&Deatherage（美国专利号2，544，681）和Renschler（美国专利号2，544，724）才首次申请专利[28]。新西兰工业首先应用电刺激改善羊肉品质，随后，在世界范围内的肉类屠宰加工业都进行了一项技术革新，即利用电刺激技术来改善肉类品质[29]。电刺激最早用来避免肉类冷收缩导致的韧化作用[30]，后来，电刺激作为肉类快速成熟技术，用来缩短肉类成熟时间，加速肉类嫩化过程[31]。并且，电刺激还可以改善肉色，避免产生热环。

1.2.3 超高压嫩化。

对尸僵前的肌肉加压可提高肉的嫩度。很多学者均报道了100～300 MPa的压力对肉进行高压处理有助于肉嫩度的提高[32]，但关于高压对肉嫩化的作用机理还有待完善[33]。试验发现，高压可以瞬间提高肌浆中钙离子的浓度，从而激活钙激活酶，降解肌纤维中的结构蛋白，导致肌原纤维完整性破坏，提高肉的嫩度。

1.2.4 注射氯化钙。Calpain的激活需要充足的钙离子，但是宰后肌肉内的钙离子浓度太低，因此，加入外源钙离子可以使Calpain充分激活，从而使肉产生最大嫩化效应。最常使用的是动脉或者肌肉注射氯化钙溶液技术来提高钙离子浓度，改善肉品质。

1.2.5 超声波处理。

超声波最早在改善肉品嫩度中的应用是美国农业调查所的Morse Solomon和John Long在1992年利用小块的高能炸药在水中爆炸所产生的超声波处理肉，破坏了肉内蛋白及联接键，降低了肉品硬度，从而达到嫩化作用。试验证实，超声波可以较好地改善肉的嫩度。

2 电刺激影响嫩度的分子机理

2.1 通过糖酵解代谢途径影响嫩度

动物屠宰后，肌肉中的能量代谢系统从开始的有氧代谢转为无氧代谢，ATP主要来源于糖原降解为乳酸及磷酸肌酸中磷酸转移给ADP [34]。肌酸激酶能够催化ATP与ADP间磷酸基团的可逆转移。前期研究中，确定了20多种肉质标记蛋白，主要有骨架蛋白质比如肌联蛋白（Titin）、伴肌动蛋白（Nebulin）、肌钙蛋白（Troponin-T）；代谢酶比如肌酸激酶（Creatine Kinase）、丙酮酸激酶（Pyruvate Kinase）、糖原磷酸化酶（Glycogen Phosphorylase）等。在屠宰后24 h的可溶性蛋白质组分中发现了肌酸激酶[35]，猪宰后总蛋白[36]及牛肉可溶性蛋白质中[37]肌酸激酶片段的丰度增加。目前，代谢酶作为肉品质标记的研究还不多，但根据前期已有蛋白质组数据表明，代谢酶将会成为很好的肉类标记蛋白。

研究认为，电刺激能够加速宰后的糖酵解[38]，而且发现有些代谢酶例如肌酸激酶和磷酸丙糖异构酶因为电刺激而导致表达改变[39]。电刺激处理使牛肉中蛋白水解酶的活性增加，也使许多关键的代谢酶水解，且这种水解和嫩化有關系[40]。并且，电刺激对嫩度的影响是通过pH与温度的相互作用来完成的。改变胴体的温度要比改变pH难，因此，在实际应用中，可以考虑在最佳的pH和温度下进行电刺激来提高牛肉的嫩度。電刺激加速胴体内糖酵解途径，防止肌肉快速冷却时的冷收缩，使胴体内能量大量消耗，ATP转化ADP为磷酸盐，释放出钙离子，乳酸积累，形成高温低pH环境，嫩度提高。

2.2 通过钙蛋白酶途径影响嫩度 物理性破坏提高牛肉嫩度的机理，可能是破坏牛肉本身提高成熟的能力，或者是物理破坏引起的某种方式，又或者是引起肌浆网中过量钙离子的释放，从而引起挛缩带的出现，导致肌原纤维的超微结构改变[41]。而挛缩带肌节的断裂有可能是因为物理破坏，也有可能是因为肌原纤维超微结构的降解，使蛋白酶更多地暴露，加快了蛋白质的降解[42]。

前期研究表明，细胞骨架蛋白Titin、Nebulin、Desmin和Troponin-T的降解使肌原纤维发生一系列的物理、化学和结构的变化，导致肌纤维小片化，破坏了肌纤维结构的完整性，并最终改善了肉嫩度[43]。电刺激后骨架蛋白：肌间线蛋白（Desmin）、肌钙蛋白-T （Troponin T α-异构体）、肌球蛋白结合蛋白H（Myosin binding protein H）表达下调。电刺激的电流经过神经系统或者直接使肌膜去极化，从而引起肌肉收缩，温度升高，pH加速降低，可能是由于改变了Calpain/Calpastatin的比例[44]，或者是由于提高肌肉钙离子浓度激活了Calpains蛋白酶体系，从而导致蛋白质的降解加速，肉嫩度提高。

2.3 通过溶酶体途径影响嫩度 溶酶体位于肌细胞的肌浆中，在哺乳动物的细胞降解机制中起重要作用。溶酶体水解酶大多数是可溶性的，主要包括糖苷酶、核酸酶、磷酸酯酶、蛋白酶、脂肪酶等，少数整合在膜上，将生物大分子水解为可吸收利用的小分子。如果酸性水解酶从溶酶体释放出来，就会破坏哺乳动物的细胞结构要素。

过氧化物氧化还原酶Prx6是溶酶体中一类重要的水解酶，Prx6是一个双功能蛋白，同时具有过氧化物氧化还原酶和溶酶体组织蛋白酶的活性[45-46]。Prx6在细胞内调控机体生长和代谢过程、肌原纤维断裂过程、宰后肌肉嫩化过程。溶酶体内的酶都是酸性水解酶，反应的最适pH约为5.0，溶酶体的膜上有质子泵，将H+泵入溶酶体，使pH降低。当细胞pH下降到5.0，酸性水解酶被激活，使溶酶體膜水解裂开，释放出溶酶体酶，导致细胞自溶。当细胞中pH接近中性时，Prx6在肌浆中发挥过氧化物氧化还原酶活性，当细胞中pH为5.0左右时，Prx6在溶酶体中发挥钙离子依赖的磷脂酶A2 活性，利用溶酶体途径来调控肉类中骨架蛋白的降解[47]。电刺激后pH不断下降，直到pH为5.4左右，钙离子浓度升高，Prx6主要发挥钙离子依赖的磷脂酶 A2 活性，溶酶体水解酶从破裂的溶酶体膜中释放出来，水解肌肉蛋白，改善嫩度。

另外，电刺激通过溶酶体途径影响嫩度也有可能是由于凋亡酶的作用。因为在细胞凋亡中，溶酶体可以消化内吞的凋亡小体，释放大量溶酶体水解酶进行坏死和自噬性细胞死亡。然而更多研究表明，溶酶体不仅可以消化内吞的凋亡小体，它所释放出的水解酶也可以引起溶酶体信号途径的凋亡，并且，电离辐射、细胞因子缺失、热等外界因素可引起内源性途径，提高线粒体膜的通透性，释放细胞色素C等凋亡相关蛋白，激活凋亡酶诱导细胞凋亡。

2.4 通过氧化应激途径影响嫩度 氧化应激，指的是生物体受到外界伤害性刺激后产生活性氧积累，产生细胞毒性，致使生物体内组织损伤的过程。生物体免疫应答需要适量活性氧，但如果活性氧水平超出抗氧化能力，就会产生氧化应答，利用抗氧化作用维持体内氧化还原平衡，引发生物膜脂质过氧化、细胞内蛋白质和酶变性、DNA损伤，从而引起细胞死亡、凋亡和组织损伤，导致疾病的发生[48]。

动物受到外界刺激后，可以引发很多条不同的信号传导途径，而且这些途径相互作用，叫做交叉作用。活性氧ROS作为一类第二信使，传递应激信号，对细胞产生各种作用。适度的ROS水平可以有效激活细胞的氧化还原敏感型信号通路如MAPK、PI3K/Akt等[49-50]，各通路之间可以相互联系，MAPK、PI3K/Akt通过磷酸化来调节hsf-1、p53、nf-κb[51]等转录因子，从而诱导一系列氧化还原敏感型基因的表达，控制细胞对生长、凋亡、应激等信号的反应。

生物体的信号传递指的是，细胞在感知到胞外刺激以后，利用细胞内信号分子的逐级传递，诱导产生一系列细胞质和细胞核事件和生理生化反应的过程。其中，MAPK级联途径在真核生物细胞内的信号传递中具有不可忽视的作用[52]。MAPK成员分为MAPK、MAPKK和MAPKKK，在信号传递时氨基酸残基磷酸化逐级被激活。MAPK激活后可能在细胞质中激活别的蛋白酶，也可能使细胞骨架磷酸化，也可能在细胞核中利用磷酸化的转录因子调控基因表达。动物细胞中的MAPK信号传导途径至少存在4条，而且激酶的激活都要在保守的位点进行双重磷酸化[53-55]。胞外信号分子作用于至少3种类型受体：酪氨酸蛋白激酶型、组氨酸蛋白激酶型、有7段的跨膜区域的蛋白受体[56]。在动物中，生长因子、激素等分别在相应酪氨酸激酶型受体及7段的跨膜区域的蛋白受体上作用，引发了ERK1/ERK2途径[57]。其中，受到Ras激活ERK1/ERK2途径很受关注。目前，国内外对于在肉类成熟的氧化应激途径中酶类的研究还很少。

过氧化物氧化还原酶Prx是近年来发现的可以保护机体细胞免受氧化剂损伤的蛋白质家族，可以清除机体内的H2O2和烷基过氧化物，通过它的过氧化物酶活性，使细胞避免氧化损伤。除了抗氧化活性外，还参与多种生物学功能，比如细胞增殖、分化、凋亡[58]、基因表达和细胞内信号转导等。其中，Prx6位于胞浆，在肺中的含量最高，具有过氧化物酶活性和磷脂酶A2活性。前期研究证明，Prx6具有过氧化物氧化还原酶活性，活性氧（ROS）诱导氧化应激，激活Prx6[59-62]，降解活性氧[63]。Yang等[64]用双向电泳技术分析大白猪和梅山猪背最长肌的差异表达蛋白，鉴定出Prx6在2个品种间表达存在着显著差异，在随后的研究工作中，把Prx6基因当做猪肉品质性状的候选基因，探索了Prx6基因的多态性与猪肉品质性状之间的关系。Prx6在pH接近中性时，发挥过氧化物氧化还原酶活性，通过p38 MAPK级联途径刺激增殖和抑制细胞凋亡。电刺激后pH不断下降，直到极限pH为5.4左右，肌浆中Ca2+浓度升高，Prx6主要发挥Ca2+依赖的磷脂酶 A2活性，通过溶酶体途径使肌肉蛋白水解，在一定程度上抑制了p38 MAPK级联途径，抑制增殖，促进氧化凋亡，嫩度提高。

另外，哺乳动物中，磷脂酰乙醇胺结合蛋白PEBP蛋白有双重作用，包括脂质结合及使丝氨酸蛋白酶受到抑制[65]。PEBP4是PEBP家族的一员，不仅抑制Raf-1-MEK1/2-ERK1/2-MAPK途径[66-67]，而且抑制能够活化AKT的JNK途径，ATK能够推动细胞侵袭和转移[68-70]。Raf 激酶抑制蛋白（Raf kinase inhibit or protein，RKIP），屬于PEBP家族，酵母双杂交的试验证明，RKIP和PEBP4可以抑制Raf-1激酶活性，在MAPK级联信号传导途径中使Raf-1及MEK1失活[71-72]。PEBP与Raf-1相互起作用，抑制Ras-MAPK级联信号传导。牛屠宰后胴体内产生活性氧，激活MAPK级联途径，PEBP与Raf-1相互起作用，抑制Ras-MAPK信号传导途径。电刺激加速PEBP抑制MAPK级联途径，抑制增殖，加速氧化凋亡，提高嫩度。

氧化應激能夠激活PI3K/Akt信号通路。PI3K（phosphoinositide 3-kinase）具有Ser/Thr激酶和磷脂酰肌醇激酶活性[73]。Akt又称PKB（protein kinase B），也是一种Ser/Thr激酶。近年的研究表明，细胞可被内外因素诱导启动PI3K/Akt传导途径，促进细胞增殖、分化、转移，抑制细胞凋亡[74-75]。研究表明， PI3K和JAK2也参与Prx6的激活[76]。

3 展望

电刺激通过糖酵解代谢途径、钙激活中性蛋白酶途径、溶酶体途径、氧化应激途径影响嫩度的信号通路表明，牛肉嫩化与氧化、凋亡有密切联系；电刺激抑制氧化应激，抑制增殖，加速氧化凋亡，加快嫩化。具体的机制还需要进一步的试验验证，比如对牛肉中基因进行分离及遗传效应分析，基因的敲除或者过表达、加抑制剂，启动子克隆和转录因子的研究，可以进行基因结构、时空表达谱、多态性及性状关联分析等方面的研究，建立其与嫩度的关系，从而指导生产。从基因水平上，进一步研究代谢通路及基因网络， 具有非常重要的理论意义。

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