烤烟生长过程中多酚类物质及其相关酶活性的变化

袁卫瑜，王兴德，李军营，蔡庆生，周 宏，焦旭勇

(1.云南省烟草农业科学研究院，云南 昆明 650031；2.南京农业大学生命科学学院，江苏 南京 210095；3.云南省烟草公司玉溪市公司华宁县分公司，云南 华宁 652800；4.湖南省烟草职工培训中心，湖南 湘潭 411104)



烤烟生长过程中多酚类物质及其相关酶活性的变化

袁卫瑜1,2，王兴德3，李军营1*，蔡庆生2，周 宏4，焦旭勇1,2

(1.云南省烟草农业科学研究院，云南 昆明 650031；2.南京农业大学生命科学学院，江苏 南京 210095；3.云南省烟草公司玉溪市公司华宁县分公司，云南 华宁 652800；4.湖南省烟草职工培训中心，湖南 湘潭 411104)

【目的】明确烤烟生长过程中叶片多酚类物质含量及其相关酶活性的变化规律，为确定云南产区适熟烟叶物质基础提供依据。【方法】在田间采集不同发育阶段的烟叶，同时在采收期设定常规采收和延迟7、14 d采收3个处理，跟踪测定了烟叶中主要多酚类物质含量及其代谢相关酶活性，并进行数理统计分析。【结果】打顶措施大幅提升烟叶中多酚含量，其中新绿原酸、绿原酸、芸香苷反应明显，莨菪亭含量不受打顶措施的影响；打顶后烟叶多酚含量逐渐回落至较低水平，并维持到烟叶进入成熟期；随着烟叶成熟度的增加(由常规采收至延迟14 d采收)，中部叶多酚总量总体呈上升趋势，上部叶在这段时期呈下降趋势；除莨菪亭外，中部和上部叶PAL活性与其他酚类物质含量均呈正相关；中部和上部叶PPO活性与酚类物质含量均呈负相关。【结论】烟叶中多酚含量随成熟度增加呈规律性变化，打顶可短暂提升烟叶多酚类物质含量，莨菪亭的变化规律不同于其它几类多酚类物质，多酚类物质含量受烟叶中多酚合成和降解酶活性控制。

烤烟；酚类；苯丙氨酸解氨酶；多酚氧化酶

【研究意义】烟叶中的多酚类物质是优质烟叶品质形成的重要物质基础，烟叶成熟度密切相关，研究烟叶生长发育过程中多酚物质含量及其代谢特征，对明确多酚类物质代谢与烟叶成熟度的关系具有重要意义。【前人研究进展】国内学者通常从比较不同成熟度烟叶的外观质量以及烤后烟叶化学成分等方面来确定烟叶成熟采收的标准[1～6]。多酚类物质作为烟叶重要的烟叶化学成分之一，对烟叶品质具有重要影响，通过影响烟叶生长发育和烘烤特性，进而对烟叶外观质量、烟气质量和风格起着重要作用[7]。苯丙氨酸解氨酶(PAL)是催化多酚类物质合成的关键酶，对烟叶中多酚类物质含量调控起限速作用[8]。多酚氧化酶(PPO)是催化多酚类物质降解的关键酶，参与多酚类物质的氧化，对烟叶的色度、色泽有重要影响[9]。【本研究切入点】成熟度作为烟叶质量的核心因素，对烟叶多酚也有重要影响[10]，不同成熟度烟叶中多酚物质含量差异较大，研究烤烟生长过程中多酚类物质及其代谢关键酶活性变化，对明确优质烟叶适宜成熟度具有重要意义。【拟解决的关键问题】文章通过研究不同发育阶段叶片多酚物质含量及其代谢关键酶活性的变化规律，为确定云南产区适熟烟叶的物质代谢基础提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验地点位于云南省玉溪市峨山县小街镇，试验时间为2012年，采用的烤烟品种为云烟87。田间试验土壤酸碱度为6.87，碱解氮160.13 mg/kg，有机质含量为4.33%，速效钾83.55 mg/kg，速效磷24.87 mg/kg。 移栽时间为4月24日，打顶时间为6月30日左右，种植密度为行距120 cm×株距50 cm，施肥量为90 kg纯氮/hm2，基追比为5∶5，追肥分2次兑水浇施。其余管理措施按当地优质烟叶生产要求进行。

1.2 样品采集与分析

在移栽后65 d时，分别挂牌标记自下而上第11和18片叶，分别代表中部叶和上部叶，之后每隔7 d采集烟叶样品1次，至移栽后100 d时结束不同生育阶段样品采集，然后再分别于中、上部叶的常规成熟、延迟7 d和延迟14 d各取样1次，用于代表不同部位的不同成熟度烟叶。取样时，先将叶片表面擦拭干净，去掉叶片尖部和基部，沿主脉将烟叶分成两部分，一部分用液氮固定，一部分杀青、烘干处理，用于多酚类物质(包括多酚总量、新绿原酸、绿原酸、莨菪亭和芸香苷)含量的测定。液氮固定的鲜样用于PPO和PAL活性测定。

N代表正常成熟，D7和D14分别代表延迟7、14 d采收。下同N, D7 and D14 in the figure represents conventional mature, delayed for 7 and 14 days, respectively. The same as below图1 烤烟生长发育过程中多酚总量的动态变化Fig.1 Dynamic changes of total polyphenols content during the growth of flue-cured tobacco

采用高效液相色谱法(YC/T202-2006)进行多酚类物质(包括多酚总量、新绿原酸、绿原酸、莨菪亭和芸香苷)含量测定；PAL活性测定采用紫外分光光度法[11]，PPO活性测定采用邻苯二酚氧化法[12]。

2 结果与分析

2.1 烤烟生长发育过程中多酚类物质含量的变化

2.1.1 多酚总量的变化 从图1可以看出，在烟叶生长发育过程中，叶片中多酚总量总体呈明显的先升后降，而后逐渐上升的变化趋势。生产上受打顶措施的影响比较大，打顶会促使烟叶中多酚物质的积累，图中移栽后72 d时多酚总量明显高于移栽后65 d的总量，之后打顶效应逐渐减弱，多酚物质含量大幅下降。随着中部和上部叶的逐渐成熟，至移栽后100 d时，烟叶中多酚物质总量处于一个稳定时期，变化不明显。叶片由正常成熟至延迟14 d采收时，中部叶多酚总量增加，而上部叶多酚总量略有减少。有研究提出多酚含量随烟叶田间成熟度的提高而增加，达到充分成熟后含量降低，多酚含量的最高值可作为烟叶充分成熟的标志，但本研究中成熟期多酚总量的变化趋势并不明显，这可能是由于酚类物质含量受品种、栽培管理和环境因素的影响而引起的。

2.1.2 新绿原酸含量的变化 从图2可以看出，打顶前后烤烟叶片新绿原酸含量变化急剧，打顶后5 d(即移栽后72 d)中部叶新绿原酸含量增加至2.47 mg/g，上部叶增加至2.54 mg/g，打顶后12 d(即移栽后79 d)新绿原酸含量均降至与打顶前同一水平。移栽79 d以后，烤烟中部和上部叶新绿原酸含量呈现逐渐上升的趋势(除移栽后100 d略有下降外)，这种上升的趋势在中部叶片中一直延续到延迟14 d采收时，延迟14 d采收的中部叶新绿原酸含量是移栽后79 d的6.0倍；总体来看，上部叶的新绿原酸含量明显低于中部叶。

图2 烤烟生长发育过程中新绿原酸含量的动态变化Fig.2 Dynamic changes of new chlorogenic acid content during the growth of flue-cured tobacco

图3 烤烟生长发育过程中绿原酸含量的动态变化Fig.3 Dynamic changes of chlorogenic acid content during the growth of flue-cured tobacco

2.1.3 绿原酸含量的变化 从图3可以看出，随着烟叶的生长发育，叶片中绿原酸含量变化趋势与新绿原酸基本相同。打顶后，叶片中的绿原酸含量大幅上升，上部叶中绿原酸含量上升幅度明显高于中部叶。打顶后(移栽后79 d)，叶片中的绿原酸含量大幅回落，在达到常规成熟时(移栽后79 d～移栽后100 d)，处于相对争稳定状态。从常规成熟到延迟14 d采收这一时期，烟叶中的绿原酸含量明显上升，以中部叶最为明显，下部叶变化上升幅度较小。

2.1.4 莨菪亭含量的变化 从图4可以看出，莨菪亭是多酚类物质重要组成部分，移栽后65 d至常规成熟时，烟叶中莨菪亭含量呈上升趋势，中、上部叶表现的变化规律相同。在移栽后100 d-常规成熟这段时间内，中部和上部叶的莨菪亭含量上升幅度明显加快，在常规成熟时，中、上部叶莨菪亭含量最大值，分别为0.13和0.14 mg/g。常规成熟-延迟14 d采收这一时期，莨菪亭含量由最大值开始下降，表明随着烟叶成熟度的增加，叶片中莨菪亭含量呈下降趋势，不同于绿原酸和新绿原酸。

图4 烤烟生长发育过程中莨菪亭含量的动态变化Fig.4 Dynamic changes of scopoletin content during the growth of flue-cured tobacco

图5 烤烟生长发育过程中芸香苷含量的动态变化Fig.5 Dynamic changes of rutin content during the growth of flue-cured tobacco

2.1.5 芸香苷含量的变化 从图5可以看出，芸香苷含量变化趋势与新绿原酸和绿原酸变化趋势基本一致，受打顶措施的诱导效应影响较大，在打顶后含量大幅上升，上部叶中芸香苷含量上升幅度大于中部叶。打顶5 d(移栽后72 d)后，叶片中芸香苷含量急骤下降，然后处于一个相对稳定的状态。在常规成熟至延迟14 d 采收这一时期，烟叶中芸香苷含量略有提升，在延迟14 d采收时，中部叶的芸香苷含量是移栽后79 d的2.8倍左右，上部叶的芸香苷含量是移栽后79 d的2.7倍左右。

2.2 烤烟生长过程中多酚相关酶活性变化

2.2.1 叶片内PAL活性的变化 PAL是催化多酚类物质合成的关键酶，从图6可以看出，在烟叶生长发育过程中，PAL的活性呈明显的多峰变化，峰值分别为打顶后5 d左右和常规成熟之后，中部叶为常规成熟时，上部叶为延迟7 d采收时。不同部位烟叶PAL活性的变化动态基本一致，但在不同时期的活性值略有不同。在打顶前后，上部叶PAL活性明显高于中部叶，这与这一时期多酚类物质(绿原酸、新绿原酸、芸香苷)含量上部叶高于中部叶的结果相一致。到成熟期前后(从移栽后93 d开始)，烟叶中PAL活性中部叶明显高于上部叶，与这时期多酚类物质含量变化趋势相一致。以上结果表明，PAL活性对调控烟叶多酚类物质含量起着重要作用。烟叶成熟度过高(延迟14 d采收)时，PAL活性明显降低，表明烟叶成熟度不能过高，否则不利于叶片中多酚类物质的合成。

图6 烤烟生长发育过程中叶片PAL活性的变化Fig.6 The PAL activity in the process of flue-cured tobacco growth and development

部位Position酶活性Enzymaticactivity多酚总量Totalpolyphenolcontent新绿原酸含量Newchlorogenicacidcontent绿原酸含量Chlorogenicacidcontent莨菪亭含量Scopoletincontent芸香苷含量Rutincontent中部叶PAL活性0．1400．2980．2610．516∗∗0．319PPO活性-0．311-0．377-0．449∗-0．288-0．311上部叶PAL活性0．610∗∗0．705∗∗0．712∗∗0．462∗0．727∗∗PPO活性-0．669∗∗-0．575∗∗-0．622∗∗-0．318-0．684∗∗

注：表中“*”代表达到5%显著水平，“**”代表达到1%显著水平。

Note: ‘*’ in the table represents 5% significant level, ‘**’ represents 1% significant level.

2.2.2 叶片内PPO活性的变化 PPO是叶片中多酚类物质降解过程的关键酶，从图7可以看出，在烤烟生长发育过程中，中、上部叶PPO活性变化幅度不大，在打顶前后，PPO活性较低，这与当时叶片中多酚类物质合成处于优势状态相对应。不同部位间PPO活性存在明显差异，表现为上部叶PPO活性明显高于中部叶，这与以前的研究结果一致[15]。

2.3 酚类物质含量与相关酶活性的相关性分析

表1显示了烤烟生长发育过程中多酚类物质含量与PAL、PPO活性的相关性，通过简单相关分析可以看出，叶片中酚类物质含量与叶片中PAL活性呈正相关关系，与PPO活性呈负相关关系，部分指标达到显著水平。但总体来看，多酚类物质含量与PAL、PPO活性的相关程度存在部位间的差异，二者相关程度上部叶明显高于中部叶。中部叶仅莨菪亭和绿原酸分别与PAL和PPO活性达1%显著水平的相关关系，而上部叶PAL活性与多酚总量、新绿原酸、莨菪亭、绿原酸和芸香苷含量均呈1%显著水平的正相关关系，PPO活性与多酚总量、新绿原酸、绿原酸以及芸香苷含量呈1%显著水平的负相关关系。

图7 烤烟生长发育过程中叶片PPO活性的变化Fig.7 The PPO activity in the process of flue-cured tobacco growth and development

3 讨 论

因多酚类物质含量多少与烟叶品质形成关系密切，所以有关烟叶中多酚类物质代谢的相关研究较多[7,9-10,15-17]。烟叶中多酚类物质含量受遗传因素、生长环境和生产措施等因素的影响较大，通过本试验的研究，可进一步明确烟叶生长发育过程中，多酚类物质含量受打顶、成熟进程和部位差异的影响。打顶是烟叶生产上的一项主要技术措施，影响烟叶中物质流的再分配，同时产生一种伤害信号，可诱导PAL等酶活性的上调，进而利于多酚类物质的大量合成，本文的研究结果进一步证实了此现象，打顶后5 d(移栽后72 d)多酚总量、新绿原酸、绿原酸和芸香苷含量大幅积累，同时控制多酚类物质生物合成的酶PAL活性明显升高。不同生长阶段的烟叶多酚类物质含量差异较大，以往研究结果表明，随着烟叶的逐渐成熟，多酚类物质含量呈现上升趋势，这与本实验的结果类似[19]，也有研究结果认为，烟草多酚含量随烟株生长和烟叶成熟度的增加而增加，烟叶达到生理成熟后多酚的积累量开始下降[17]，这可能与所研究叶片的材料不同有关，本研究结果显示，中部叶在过成熟时(延迟14 d采收)时叶片中多酚类物质含量呈增加积累趋势，而上部叶则呈略下降趋势。

4 结 论

通过本研究，可以得到如下结论：①打顶可短暂提升烟叶多酚类物质含量，莨菪亭的变化规律不同于其它几类多酚类物质；②烟叶中多酚含量随成熟度增加呈规律性变化，但因部位不同略有差异。③烟叶中多酚类物质含量与PAL和PPO酶活性成显著相关，上部叶比中部叶更为明显。酚类物质及相关酶活性可作为判断烟叶适宜的成熟采收时间的指标，但并非唯一标准，判断烟叶适宜采收时间还需要综合参考烤烟生长过程中化学成分含量和激素水平等多方面的变化规律，为烟叶适时采收提供科学的理论依据。

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(责任编辑 王家银)

Changes of Polyphenols and Related EnzymeActivities during Flue-cured Tobacco Growth

YUAN Wei-yu1,2, WANG Xing-de3, LI Jun-ying1*, CAI Qing-sheng2, ZHOU Hong4, JIAO Xu-yong1, 2

(1.Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences, Yunnan Kunming 650031, China; 2.College of Life Science, Nanjing Agricultural University, Jiangsu Nanjing 210095, China; 3.Huaning Branch of Yuxi Tobacco Company, Yunnan Huaning 652800, China; 4.Employee Training Center of Hunan Tobacco, Hunan Xiangtan 411104, China)

【Objective】In order to define the suitable harvest time of flue-cured tobacco, polyphenols content and its related enzyme activity change of leaves during flue-cured tobacco growth process were studied. 【Method】Tobacco leaves of different growing stage from three harvest time treatments (normal, delay 7 d and delay14 d) were collected to measure the content of polyphenols and activity of polyphenols metabolism related enzyme.【Result】Results showed that topping could great stimulate polyphenols content, especially new chlorogenic acid, chlorogenic acid and rutin, but not including scopoletin. Polyphenols content decreased after topping, and maintained a low level in maturing stage. From normal harvest to delay 14 d, polyphenols content in middle part leaf increased, but decreased in upper part leaf. Except for scopoletin, PAL activity for both middle part leaf and upper part leaf correlated positively with polyphenols content. PPO activity for both middle part leaf and upper part leaf correlated negatively with polyphenols content. 【Conclusion】Polyphenols content was changed regularly with tobacco leaf maturing, and topping could stimulate transitorily polyphenols content, and scopoletin had a different change law from other polyphenols. The content of polyphenols was controlled by the activities of polyphenols related synthesis and degradation enzymes.

Flue-cured tobacco; Polyphenols; Phenylalanine ammonialyase; Polyphenol oxidase

1001-4829(2017)7-1528-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.7.011

2015-06-16

云南省烟草公司科技计划项目(2016YN28)；云南中烟科技计划项目(2016YL03)

袁卫瑜(1987-)，女，河南舞钢人，硕士，主要从事烟草栽培生理研究，E-mail:1530877729@qq.com，*为通讯作者：李军营，E-mail: 83754331@qq.com，主要从事烟草栽培研究，Tel:(0871)65106249。

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