肝细胞癌患者血清miR—155的表达及临床意义

李土华?官成浓?李跃

[摘要] 目的 研究肝細胞癌（HCC）患者血清中microRNA-155（miR-155）的表达水平及其临床意义。 方法 采用实时荧光定量PCR的方法检测50例HCC患者的术前血清及50例健康人血清的miR-155相对表达量，分析血清miR-155表达水平与临床病理参数及术后1年无复发生存（RFS）率的关系。 结果 31例（62%）HCC患者血清miR-155相对表达量高于健康人血清（P=0.03），血清miR-155表达与HCC癌组织的Edmonson分级（P=0.01）及脉管侵犯（P=0.02）相关，而与年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤个数、肝硬化、分期、HBV DNA拷贝数及AFP均无关（P>0.05）。单因素分析显示脉管侵犯及肝硬化与术后1年RFS率低正相关。血清miR-155高表达者比低表达者1年RFS率低（45.9% vs76.6%），差异有统计学意义（P=0.02）。多因素分析显示脉管侵犯（P=0.15）及miR-155（P=0.05）是影响HCC患者术后1年RFS率的独立危险因素。 结论 血清miR-155是一个对HCC恶性程度的判断、侵袭性生物学行为的预测和术后预后评估都很有价值的生物指标。

[关键词] miR-155；肝细胞癌；血清；预后

[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2017）11-09-06

Expression of serum miR-155 of patients with hepatocellular carcinoma and its clinical significance

LI Tuhua1 GUAN Chengnong2 LI Yue3

1.Center of Oncology，The Affiliated Hospital of Guangdong Medical University，Zhanjiang 524001，China；2.The Second Clinical Medical College，Guangdong Medical University，Dongguan 523808，China；3.Graduate School，Guangdong Medical University，Zhanjiang 524001，China

[Abstract] Objective To research the expression level of serum microRNA-155 （miR-155） of patients with hepatocellular carcinoma （HCC） and its clinical significance. Methods Preoperative serum of 50 patients with HCC and relative expression of serum miR-155 of 50 healthy cases were detected by real-time fluorescence quantitative PCR.Relationships between expression level of serum miR-155 and clinical pathological parameters and rate of recurrence-free survival （RFS） of one year after operation were analyzed. Results Relative expression of serum miR-155 of 31 patients （62%） with HCC was higher than that of healthy cases（P=0.03）. Expression of serum miR-155 was related to Edmonson grading of HCC（P=0.01） and vessel invasion（P=0.02）.But it had no relation with age，sex，size of tumors，number of tumors，cirrhosis，staging，HBV DNA copy number and AFP （P>0.05）.Univariate analysis showed that vascular invasion and liver cirrhosis was positively correlated with RFS rate of one year after operation.RFS rate of one year after operation of patients with high expression of serum miR-155 was lower than that of patients with low expression of serum miR-155（45.9% vs76.6%）.The differences was statistically significant （P=0.02）.Multivariate analysis showed that vascular invasion（P=0.15） and miR-155（P=0.05） were independent risk factors for RFS rate of one year after operation of patients with HCC. Conclusion Serum miR-155 is a biological index of great value to evaluate malignant degree， predict invasive biological behavior and evaluate postoperative prognosis.

[Key words] MiR-155；Hepatocellular carcinoma；Serum；Prognosis

原发性肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上恶性程度最高的恶性肿瘤之一，每年全球新发病例数有50%在中国[1]。中国癌症死因顺位HCC位列第三位[2]。探讨HCC早期诊断及预后预测的生物学指标有重要意义。自从miRNA

在2008年在血液中被首次发现以来，循环miRNAs就被认为可能是恶性肿瘤辅助诊断和判断预后的重要生物标记物。MiR-155是miRNA的一种，位于人类 21 号染色体上BIC（b-cell integration cluster）基因的第三个外显子内[3]。研究表明，miR-155对肿瘤的发生发展密切相关，发挥癌基因的作用[4]。循环miR-155的研究是目前的热点之一。循环miR-155在乳腺癌[5]、肺癌[6]及结直肠癌[7]等恶性肿瘤的早期诊断、良恶性鉴别、复发、转移或生存等预后预测方面均有重要临床应用价值。但是目前有关循环miR-155在HCC患者中的表达情况及临床意义的研究，国内外尚无报道。因此，本研究采用实时荧光定量PCR的方法对HCC患者及健康人血清中miR-155的表达水平进行对比研究，并进一步探讨循环miR-155与HCC患者术后1年无复发生存（relapse-free survival，RFS）率的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

50例HCC患者均为广东医科大学附属医院肝胆外科2014年1月～ 2015年12月的住院患者。其中男45例，女5例；年龄29～75岁，年龄中位数 48岁；肿瘤最大径≥5cm的14例，<5cm的36例；肿瘤分化程度：高、中分化26例，低、未分化24例；肿瘤单发29例，多发11例；有脉管侵犯9例，无脉管侵犯41例；血清AFP≥400ng/mL 17例，AFP<400ng/mL 33例；HbsAg≥500copies/mL 19例，<500 copies/mL 31例；按国际抗癌联盟（UICC）临床TNM分期，I期30例，II期20例。有肝硬化23例，无肝硬化27例。所有患者术前均未接受过化疗、放疗、介入、靶向、及非甾体类抗炎药等治疗。对照组为50例同期健康体检人群，其中男45例，女5例，年龄中位数47岁，无心、肝、脑、肺、肾等重要器官疾病史及消化道和婦科疾病史。

1.2 主要试剂

MiRcute miRNA提取分离试剂盒、miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒、miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒由北京天根公司提供；miR-155引物及内参U6引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3 检测方法

1.3.1 标本采集 在患者入院后第1天空腹抽取静脉血3mL，离体2h内在4℃、12000r/min×10min条件下进行血清分离。然后把血清保存在-80℃冰箱，直至RNA提取。同样的方法采集、分离和保存健康体检人员血清。

1.3.2 RNA提取 实验组及健康对照组血清均使用天根生化科技（北京）有限公司生产的miRcute miRNA提取分离试剂盒进行miRNA的提取，将提取出的miRNA保存与-80℃冰箱以备下一步实验使用。

1.3.3 miRNA的cDNA合成 选用天根生化科技（北京）有限公司miRcute miRNA第一链的合成试剂盒，严格按照试剂盒操作说明书操作，合成后的cDNA保存与-20℃冰箱已备下一步实验使用。

1.3.4 miRNA的实时荧光定量检测 采用天根生化科技（北京）有限公司生产的miRcute-miRNA荧光定量检测试剂盒，扩增反应在实时定量仪LightCycler480上进行。血清以U6为内参基因，用实时荧光定量PCR的方法，检测miR-155在血清中的表达情况。HCC患者血清及健康人血清miR-155表达量比较采用2-ΔCt法，待测miR-155相对表达量计算公式为RQ=2-ΔΔCt。每个样品配置3个复孔，且连续3次独立实验以校正实验结果，同时做空白对照组以提高实验可靠性。

1.4 统计学方法

实验数据采用SPSS17.0统计学软件分析，不符合正态分布的计量资料结果用中位数及四分位数间距（25%，75%）表示。HCC患者及健康者血清miR-155的表达量比较应用Wilcoxon符号秩和检验。不同临床病理学特征分组的miR-155表达比较应用Mann-Whitney检验。生存曲线采用Kaplan-Meier法绘制，并进行Log-Rank检验。采用Cox比例风险回归模型进行多因素分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MiR-155在HCC患者血清及健康人血清中的表达

50例HCC患者血清及50例健康人血清的miR-155的平均表达量数据为非正态分布，以中位数及四分位数间距（25%，75%）表示分别为0.06（0.03，0.14）、0.02（0.01，0.06）。HCC患者血清miR-155的平均表达量高于健康人血清，差异有统计学意义（P=0.03）。有68%（34/50）的HCC患者血清miR-155相对于健康对照组血清表达上调，表达水平平均上调3.24倍，95%CI（2.67，3.98）。见表1、图1。

表1 nmiR-155在HCC患者血清及健康人血清中的表达结果分析

组别 n miR-155的相对表达量

HCC患者 50 0.06（0.03，0.14）

健康人对照组 50 0.02（0.01，0.06）

P 0.03

图1 miR-155在HCC患者及健康人血清中的表达

2.2 HCC患者血清miR-155表达水平与临床病理参数之间的关系

血清miR-155表达水平与HCC Edmonson分级、脉管侵犯相关。在Edmonson分级III/IV级、有脉管侵犯的患者血清中的表达水平明显高于Edmonson分级I/II级、无脉管侵犯者患者（P<0.05）；血清miR-155的表达水平与患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤个数、肝硬化、分期、HBV DNA拷贝数及AFP均无关（P>0.05）。见图2、3，表2。

图2 血清miR-155表达与病理分级的关系

图3 血清miR-155表达与脉管侵犯的关系

2.3 肝细胞癌术后1年无复发生存（relapse-free survival，RFS）率的影响因素

2.3.1 随访结果 对50例HCC患者术后进行住院、门诊或者电话随访，随访频率每3～4个月一次。通过患者症状体征、AFP和影像学检查等资料，监测疾病复发情况，随访截止时间2016年12月31日。术后生存时间按月计算，以手术当天开始计算时间。本研究中，50例行肝癌根治性切除术的患者术后随访期间共有3例患者失访，失访率6%。随访时间12个月时，有18例患者出现复发，1年RFS率64%。

2.3.2 患者临床病理参数与HCC术后1年RFS率的关系 把50例患者的临床病理参数用Kaplan-Meier法进行单因素生存分析，结果显示有脉管侵犯（HR3.89，95%CI 1.29 ～ 11.91，P=0.01）和肝硬化（HR2.68，95%CI 1.03 ～ 7.01，P=0.03）的患者与术后1年RFS率低正相关，见表2、图4、5。

2.3.3 血清miR-155水平与HCC术后1年RFS率的关系 把血清miR-155在HCC患者相对健康对照组的表达水平≥3.24倍定义为高表达，小于3.24倍为低表达。把50例患者分为高表达组（31例）和低表达组（19例）。用Kaplan-Meier法进行单因素生存分析。结果显示miR-155高表达组1年RFS率（45.9%）明显低于低表达组（76.6%），差异有统计学意义（HR2.77，95%CI 1.02 ～ 7.51，P=0.02）。见表2、图6。

图4 脉管侵犯与术后1年RFS率的关系

图5 肝硬化与术后1年RFS率的关系

表2 单因素分析影响术后1年RFS率的因素

因素 n 术后1年RFS率（%） HR及95%CI Log-Rank test

χ2 P

性别 2.24 0.13

男 45 65.2 0.41（0.07 ～ 2.34）

女 5 40 2.47（0.43 ～ 14.26）

年龄 0.01 0.92

≥50岁 22 62.2 1.0500（0.4133 ～ 2.6680）

<50岁 28 63.2 0.9524（0.3748 ～ 2.4198）

Edmonson分级 2.11 0.15

Ⅰ/Ⅱ级 26 71.1 0.51（0.20 ～ 1.29）

Ⅲ/Ⅳ 24 53.8 1.97（0.78 ～ 4.99）

肿瘤大小 2.84 0.09

≥5cm 14 49 2.19（0.72 ～ 6.62）

<5㎝ 36 67.8 0.46（0.15 ～ 1.38）

肿瘤个数 0.44 0.51

1个 29 65.8 0.71（0.23 ～ 2.19）

≥2个 11 51.1 1.41（0.46 ～ 4.34）

脉管侵犯 5.64 0.01*

有 9 38.9 3.89（1.29 ～ 11.91）

无 41 67.6 0.35（0.08 ～ 1.45）

肝硬化 4.69 0.03*

有 9 45.6 2.68（1.03 ～ 7.01）

无 27 75 0.37（0.14 ～ 0.97）

AJCC TNM分期 1.92 0.16

Ⅰ期 30 73.2 0.49（0.19 ～ 1.26）

Ⅱ期 20 55.8 2.02（0.79 ～ 5.13）

HBv DNA 0.84 0.35

≥500copies/mL 19 56.4 1.60（0.62 ～ 4.15）

<500copies/mL 31 72.7 0.62（0.24 ～ 1.62）

AFP 0.03 0.87

≥400ng/mL 17 61.4 1.08（0.40 ～ 2.92）

<400ng/mL 33 63.2 0.92（0.34 ～ 2.49）

miR-155 5.18 0.02*

高表達 31 45.9 2.77（1.02 ～ 7.51）

低表达 19 76.6 0.36（0.13 ～ 0.98）

图6 miR-155与术后1年RFS率的关系

2.3.4 影响HCC患者术后1年RFS率的多因素分析 将上述单因素分析差别有统计学意义的3个变量，即脉管侵犯、肝硬化及miR-155带入Cox比例风险回归模型，结果显示脉管侵犯（P=0.15）及miR-155（P=0.05）是影响HCC患者术后1年RFS率的独立危险因素。1年RFS率预测方程总的χ2=11.88，P=0.01，方程建立合理。见表3。

3 讨论

近年来研究发现，血液中miRNA可由肿瘤组织的主动分泌及肿瘤细胞的选择性分泌进入血液产生，或者由肿瘤细胞凋亡、坏死释放产生[8-9]。miRNA在血液中可以抵抗循环核糖核酸酶的降解，保持长期稳定。体外标本在高温煮沸、多次反复冻

表3 多因素分析影響术后1年RFS率的因素

变量 b SE Wald P Exp（b） Exp（b）的95% CI

脉管侵犯 1.38 0.57 5.93 0.015 3.96 1.32～11.94

肝硬化 0.75 0.51 2.17 0.14 2.12 0.78～5.72

miR-155 1.11 0.52 3.83 0.05 2.74 1.00～7.51

融、高或低的PH值、RNA酶等条件下均不会降解，而且不同疾病有不同的miRNAs表达谱[10]。表明循环miRNA可能是潜在的新型肿瘤标志物。目前循环miR-155也是研究热点之一。

研究表明，miR-155与HCC的发生、发展密切相关。高表达的miR-155可以上调癌基因IGF-II和IGF-IR的表达，并且下调抑癌基因IGFBP-3的表达，导致HCC细胞的癌变[11]。此外，miR-155可以靶向抑制ARID-2基因的表达，增强Akt信号传导通路的激活，从而促进HCC癌细胞的生长[12]。既往研究发现在HCC肿瘤组织中miR-155表达水平较癌旁非癌性组织明显升高[13]。而对于HCC患者血清中的miR-155表达情况，目前尚未明确。本研究发现在HCC患者血清中miR-155的平均表达量也明显高于健康人，差异有统计学意义（P=0.03）。并且血清miR-155表达水平与HCC Edmonson分级、脉管侵犯相关。在Edmonson分级III/IV级、有脉管侵犯的患者血清中的表达水平明显高于Edmonson分级I/II级、无脉管侵犯者患者（P<0.05）。提示监测血清miR-155的表达水平可以用于判断HCC的恶性程度及预测其侵袭性生物学行为。

手术切除是原发性肝癌最主要、最有效的治疗方法，但肝癌根治术后复发率很高。HCC根治术后1年内的复发率（大约19%～43%）比1年后的复发率更高、预后更差，并将HCC根治术后1年内复发定义为早期复发[14-16]。在本研究中，50例患者术后1年复发率36%，1年RFS率64%，与文献报道结果相仿。蔡新然等[17]回顾性分析了110例根治性切除术后HCC患者的复发情况，发现门静脉分支癌栓是早期复发相关的唯一危险因素。陈星等[15]研究表明脉管侵犯影响直径≤5cm单发小肝癌手术切除后无进展生存的独立危险因素。在本研究中，多因素分析显示脉管侵犯（P=0.02）是影响HCC患者术后1年RFS率的独立危险因素。结果也与蔡新然及陈星等学者的研究结果一致。表明对于有脉管侵犯的患者，术后更应该密切随访，以便及时发现早期复发的情况。

miR-155与HCC预后也密切相关。Huang等[18]研究发现miR-155与HCC根治术后5年无复发生存率相关，高表达miR-155的患者5年RFS率比低表达的患者显著降低（HR=2.002，95%CI 1.324 ～ 3.027）。Guang等[13]研究检测了HCC组织中miR-155的表达，发现高表达的患者较低表达者1年RFS率低（48% vs 73.3%），但差异无统计学意义（P=0.105），提示miR-155并不是预测肝癌早期复发的指标。目前尚无检测循环miR-155用于预测判断HCC早期复发情况的研究报道。在本研究中，单因素生存分析显示miR-155高表达组1年RFS率（45.9%）明显低于低表达组（76.6%），差异有统计学意义（HR2.77，95%CI 1.02 ～ 7.51，P=0.02）。多因素分析显示miR-155（P=0.05）是影响HCC患者术后1年RFS率的独立危险因素。因此，提示术前血清miR-155也是一个可用于预测评估HCC患者早期复发情况的有价值的生物标志物。

[参考文献]

[1] Ferlay JSI，Ervik M，Dikshit R，et al.GLOBOCAN 2012 v1.0，Cancer Incidence and Mortality Worldwide：IARC CancerBase No.11.Lyon[M].France：International Agency for Research on Cancer，2013.

[2] Chen W，Zheng R，Baade PD，et al.Cancer statistics in China，2015[J].CA Cancer J Clin，2016，66（2）：115-132.

[3] Lagos-Quintana M，Rauhut R，Yalcin A，et al.Identification of tissue-specific microRNAs from mouse[J].Curr Biol，2002，12（9）：735-739.

[4] Chen Z，Ma T，Huang C，et al.The pivotal role of microRNA-155 in the control of cancer[J].J Cell Physiol，2014，229（5）：545-550.

[5] Sochor M，Basova P，Pesta M，et al.Oncogenic microRNAs：miR-155，miR-19a，miR-181b，and miR-24 enable monitoring of early breast cancer in serum[J].BMC Cancer，2014，14（1）：448-454.

[6] Munagala R，Aqil F，Gupta RC.Exosomal miRNAs as biomarkers of recurrent lung cancer[J].Tumour Biol，2016，37（8）：10703-10714.

[7] Lv Z C，Fan Y S，Chen H B，et al.Investigation of microRNA-155 as a serum diagnostic and prognostic biomarker for colorectal cancer[J].Tumour Biol，2015，36（3）：1619-1625.

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[8] El-Hefnawy T，Raja S，Kelly L，et al.Characterization of amplifiable，circulating RNA in plasma and its potential as a tool for cancer diagnostics[J].Clin Chem，2004，50（3）：564-573.

[9] Pigati L，Yaddanapudi SC，Iyengar R，et al.Selective release of microRNA species from normal and malignant mammary epithelial cells[J].PLoS One，2010，5（10）：e13515.

[10] Chen X，Ba Y，Ma L，et al.Characterization of microRNAs in serum：a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases[J].Cell Res，2008，18（10）：997-1006.

[11] El Tayebi H M，Waly A A，Assal R A，et al. Transcriptional activation of the IGF-II/IGF-1R axis and inhibition of IGFBP-3 by miR-155 in hepatocellular carcinoma[J].Oncol Lett，2015，10（5）：3206-3212.

[12] Zhang L，Wang W，Li X，et al.MicroRNA-155 promotes tumor growth of human hepatocellular carcinoma by targeting ARID2[J].Int J Oncol，2016，48（6）：2425-2434.

[13] Guan C，Yang F，He X，et al.Clinical significance of microRNA-155 expression in hepatocellular carcinoma[J].Oncol Lett，2016，11（2）：1574-1580.

[14] Poon R T，Fan S T，Ng I O，et al.Different risk factors and prognosis for early and late intrahepatic recurrence after resection of hepatocellular carcinoma[J].Cancer，2000，89（3）：500-507.

[15] 陳星，李强，荀晓冬，等.微血管侵犯对单发小肝癌患者术后无进展生存期的影响[J].中华肝胆外科杂志，2016，2（22）：94-98.

[16] 孙建，简志祥，区应亮，等.肝癌根治性切除术后早期复发时限和模式的确定及其对预后的影响[J].实用医学杂志，2011，40（10）：1748-1750.

[17] 蔡欣然，黄长玉，周良艺，等.原发性肝癌根治术后不同复发时期高危因素及疗效研究[J].实用肿瘤杂志，2010，25（5）：560-563.

[18] Huang Y H，Lin K H，Chen H C，et al.Identification of postoperative prognostic microRNA predictors in hepatocellular carcinoma[J].PLoS One，2012，7（5）：e37188.

（收稿日期：2017-04-08）