食管胃交界部腺癌组织中Cx43、MT1-MMP表达及意义

苗杰，韩永强，邸永辉，付琳，李辉(河北医科大学附属邢台人民医院，河北邢台054001)



食管胃交界部腺癌组织中Cx43、MT1-MMP表达及意义

苗杰，韩永强，邸永辉，付琳，李辉
(河北医科大学附属邢台人民医院，河北邢台054001)

目的 观察食管胃交界部腺癌组织中缝隙连接蛋白43(Cx43)、膜型基质金属蛋白酶1(MT1-MMP)的表达，探讨其与肿瘤发生、发展及转移的关系。方法 采集108例食管胃交界部腺癌组织(肿瘤组)、30例癌旁正常黏膜组织(正常组)、40例异型增生胃黏膜组织(增生组)。应用免疫组化法检测Cx43、MT1-MMP表达，并分析二者异常表达与患者临床病理资料的关系，采用Pearson相关分析法分析Cx43与MT1-MMP在食管胃交界部腺癌组织中表达的相关性。结果 Cx43在正常组、增生组和肿瘤组中的阳性表达率分别为86.7%、52.5%、31.5%，正常组高于增生组和肿瘤组，增生组高于肿瘤组(P均<0.05)；MT1-MMP在正常组、增生组和肿瘤组中的阳性表达率分别为10.0%、27.5%、80.6%，正常组低于增生组和肿瘤组，增生组低于肿瘤组(P均<0.05)。食管胃交界部腺癌患者中，肿瘤组织高/中分化、浸润深度未及浆膜层、无淋巴结转移者的Cx43阳性率高于低/未分化、浸润深度侵及浆膜层、有淋巴结转移者；肿瘤组织低/未分化、浸润深度侵及浆膜层、有淋巴结转移者的MT1-MMP阳性率高于高/中分化、浸润深度未及浆膜层、无淋巴结转移者(P均<0.05)。Cx43和MT1-MMP在食管胃交界部腺癌组织中的表达呈负相关(r=-0.221，P<0.05)。结论 食管胃交界部腺癌组织中Cx43表达降低、MT1-MMP表达升高，二者在食管胃交界部腺癌的发生、发展过程中起重要作用。

食管胃交界部腺癌；缝隙连接蛋白43；膜型基质金属蛋白酶

食管胃交界部腺癌是指发生在食管胃交界区域内的腺癌，从解剖学的角度包括食管远端腺癌和胃贲门腺癌。近年来，全世界范围内食管胃交界部腺癌的发病比例逐年上升[1]。缝隙连接是细胞之间普遍存在的一种联系方式，参与细胞间能量和信息的传递、电信号传导的电偶联、细胞间物质交换的代谢偶联，在调节细胞增殖分化、凋亡及内环境的稳定等过程中发挥重要作用。该通道的主要成分是缝隙连接蛋白(Cx)。Cx43基因被认为是非突变型抑癌基因[2]，其表达异常及其导致的细胞间隙连接通讯(GJIC)功能改变与多种恶性肿瘤的发生发展、浸润转移有关[3]。膜型基质金属蛋白酶1(MT1-MMP)是基质金属蛋白酶(MMPs)家族中重要的一员，能降解细胞外基质及血管基膜，从而促进肿瘤细胞浸润和血管形成。作为两种重要的细胞间和细胞间质相互作用因子，Cx43与MT1-MMP在恶性肿瘤中表达的关系尚无报道。本研究通过观察Cx43和MT1-MMP在食管胃交界部腺癌组织中的表达情况，探讨其与肿瘤发生、发展及转移的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2009年1月～2011年12月邢台市人民医院胃镜活检和胃体外科手术切除标本，其中食管胃交界部腺癌标本108例(肿瘤组)，癌旁正常黏膜组织30例(正常组)，异型增生的黏膜组织40例(增生组)。肿瘤组男69例、女39例，年龄38～79岁、中位年龄65岁；组织学高分化57例，低分化51例，浸润深度侵及黏膜层及黏膜下层组49例，侵及肌层、浆膜层组59例；合并淋巴结转移47例，无淋巴结转移61例。患者术前均未接受放化疗和其他治疗。正常组取自肿瘤组癌旁大于2 cm处正常组织。增生组男26例，女14例，年龄28～72岁，中位年龄62岁。三组的性别、年龄具有可比性。

1.2 检测方法 采用免疫组化法。将组织标本用4%中性甲醛固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续切4 μm厚切片，脱蜡至水。加入0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液高压抗原修复，3%去离子过氧化氢阻断内源性过氧化物酶；分别滴加Cx43兔抗人多克隆抗体(1∶200)和MT1-MMP兔抗人单克隆抗体(1∶200)4 ℃孵育过夜，加入二抗室温孵育30 min。DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。用已知的阳性切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判定 由两名高年资病理科医师采用双盲法确认。Cx43阳性表达颗粒呈黄色或棕褐色，定位于细胞质及细胞膜上，根据染色强度及阳性细胞数进行半定量分析判定。在染色均匀的区域，选取5个高倍视野(×400)。首先以着色强度评分，无着色为0分，浅黄色为1分，浅棕色为2分，棕色为3分；再按阳性细胞百分率评分，<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分；将两评分相加，0～2分为阴性，≥3分为阳性。MT1-MMP阳性表达颗粒呈黄色或棕褐色，先以染色强度评分，无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；再按阳性细胞百分比评分，无阳性细胞为0分，阳性细胞1～10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分；将两评分相乘，1～2为阴性，≥3为阳性。

1.4 统计学方法 采用SPSS15.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验，相关性分析采用Pearson相关。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组Cx43、MT1-MMP阳性表达率比较 Cx43蛋白在正常组、增生组、肿瘤组的阳性表达率分别为86.7%(26/30)、52.5%(21/40)、31.5%(34/108)，正常组高于增生组和肿瘤组，增生组高于肿瘤组(P均<0.05)。MT1-MMP在正常组、增生组、肿瘤组的阳性表达率分别为10.0%(3/30)、27.5%(11/40)、80.6%(87/108)，正常组低于增生组和肿瘤组，增生组低于肿瘤组(P均<0.05)。

2.2 不同临床病理参数食管胃交界部腺癌患者肿瘤组织中Cx43、MT1-MMP阳性率比较 食管胃交界部腺癌患者中，肿瘤组织高/中分化、浸润深度未侵及浆膜层、无淋巴结转移者的Cx43阳性率高于低/未分化、侵及浆膜层、有淋巴结转移者；肿瘤组织低/未分化、浸润深度侵及浆膜层、有淋巴结转移者的MT1-MMP阳性率高于高/中分化、未侵及浆膜层、无淋巴结转移者(P均<0.05)。不同性别、不同年龄患者的Cx43、MT1-MMP阳性率比较无统计学差异(P均>0.05)。见表1。

表1 不同临床病理参数患者食管胃交界部腺癌组织中Cx43、MT1-MMP阳性率比较

2.3 食管胃交界部腺癌组织中Cx43与MT1-MMP表达的相关性 108例食管胃交界部腺癌组织中，Cx43和MT1-MMP均阳性23例，均阴性10例，Cx43阳性、MT1-MMP阴性11例，Cx43阴性、MT1-MMP阳性64例。在肿瘤组织中Cx43与MT1-MMP的表达呈负相关(r=-0.221，P<0.05)。

3 讨论

细胞通讯是指生物体细胞与细胞间以化学物质或电信号传导信息的传导机制，是维持机体正常组织结构和功能的基础[4]。细胞间的连接有紧密连接、桥粒和缝隙连接等多种结构，其中缝隙连接通道是细胞间直接进行物质交流的惟一膜通道结构，其结构基础为相邻细胞膜上连接子的相互连接。一个连接子由6个哑铃型蛋白单体聚合环绕而成，该蛋白亚单体即为Cx。GJIC允许相对分子质量小于1×103的小分子物质通过，完成细胞间信息、能量和物质交换功能，对细胞的内环境稳定、新陈代谢、增殖分化等过程起着重要的调控作用。Cx43是Cx基因家族中数量最多、分布最广且最为重要的成员，除分化的红细胞、骨骼肌及成熟精子细胞外，在人类几乎所有的组织和细胞中都有表达。它是缝隙连接通道的重要组成部分，其组成的连接子在质膜上以成簇形式出现，形成间隙连接斑，在细胞间信号传递中发挥着重要作用，其数量与GJIC的功能密切相关。Cx43在皮肤疾病、神经系统[5]及心血管疾病[6]的生理病理变化过程中发挥重要作用。近年研究发现，Cx43基因是一种抑癌基因，可能通过介导细胞外环境旁分泌信号分子的释放等途径，对绝大多数肿瘤细胞的生长起抑制作用。在许多肿瘤中Cx43基因失活，表达减少或缺失，造成GJIC功能减退，细胞间信号传递受到影响，造成内环境不稳定，为肿瘤细胞发生恶性转化提供了条件[7]。已有报道，Cx43在前列腺癌[8]、卵巢癌、乳腺癌、甲状腺癌[9]等多种肿瘤中表达下降或缺失。本研究显示，食管胃交界部腺癌组织中Cx43的表达低于正常黏膜组织，在高/中分化、未侵及浆膜层及无淋巴结转移癌组中的表达高于低/未分化、侵及浆膜层及淋巴结转移组。说明Cx43参与了食管胃交界部腺癌的发生和进展，影响其生物学行为并与其恶性程度相关。

MMPs是一个Zn2+依赖的、具有广泛底物特异性的蛋白水解酶大家族。MT1-MMP是MMPs家族重要成员，它不但可以直接降解Ⅰ型和Ⅱ型胶原、纤维黏连蛋白、层黏连蛋白、玻黏蛋白和蛋白多糖[10]等细胞外基质成分，而且还可以激活MMP-2降解基质、促进VEGF等多种促血管生长因子表达、穿透血管壁和淋巴管壁以及帮助肿瘤细胞逃避宿主的免疫反应，促进肿瘤细胞的浸润和转移。近年研究发现，MT1-MMP在多种肿瘤中过表达与肿瘤发生、进展密切相关，如神经母细胞瘤[11]、头颈部癌、膀胱癌、乳腺癌[12]等。本研究结果显示，MT1-MMP在食管胃交界部腺癌组织中的阳性表达率为80.6%，高于正常食管胃交界部组织，MT1-MMP在低/未分化、侵及浆膜层及有淋巴结转移的食管胃交界部腺癌组织中的表达高于高/中分化、未侵及浆膜层及淋巴结无转移组。说明MT1-MMP表达越高，EGJA浸润程度就越深，淋巴结转移的可能性就越大。提示MT1-MMP可能促进了食管胃交界部腺癌的发生、发展和转移。

本研究显示，Cx43与MT1-MMP在食管胃交界部腺癌组织中的表达呈负相关。提示Cx43和MT1-MMP蛋白可能相互作用，参与了食管胃交界部黏膜上皮细胞癌变的发生及发展。De Bock等[13]研究发现，在急性炎症时，MMP可以与Cx43的C-末端形成连接，并影响后者的缝隙通道功能。Liew发现给大鼠静脉注射TNF-α后，大动脉组织内MMP-2水平升高并伴随Cx40的下降。Givvmani等[14]发现，TIMP-2基因敲除小鼠的心脏压力负荷与MMP-9、MT1-MMP水平升高密切相关，并且导致心内膜Cx37和Cx43水平明显下降，进而加重心功能异常。但Cx43与MT1-MMP在肿瘤中的具体相互作用机制尚有待研究。

综上所述，Cx43蛋白的低表达和MT1-MMP的高表达，均可能参与了食管胃交界部腺癌的侵袭和转移过程，对它们相互作用机制的进一步深入研究，有望为该肿瘤的治疗提供新思路。

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