藜麦种子黄酮含量的快速检测技术研究

董艳辉于宇凤李亚莉赵兴华王亦学任 元王 鑫贺文洋任永康刘 江曹秋芬秦永军

（1山西省农业科学院生物技术研究中心，太原 030031；2农业部黄土高原作物基因资源与种质创新重点实验室，太原 030031；3山西省投资咨询与发展规划院，太原 030013；4山西农业大学，太谷 030801；5左权县园林局，左权 032600；6山西省农业科学院作物科学研究所，太原 030031）

藜麦种子黄酮含量的快速检测技术研究

董艳辉1，2于宇凤1李亚莉1赵兴华1王亦学1任 元2王 鑫3，4贺文洋5任永康6刘 江1曹秋芬1，2秦永军1，2

（1山西省农业科学院生物技术研究中心，太原 030031；2农业部黄土高原作物基因资源与种质创新重点实验室，太原 030031；3山西省投资咨询与发展规划院，太原 030013；4山西农业大学，太谷 030801；5左权县园林局，左权 032600；6山西省农业科学院作物科学研究所，太原 030031）

为了研究藜麦种子黄酮含量与超微弱发光之间的关系，本研究对筛选的90份藜麦材料进行了超微弱发光研究和黄酮含量测定，通过二者的相关性分析得出藜麦种子的黄酮含量与超微弱发光值之间呈极显著负相关（r=-0.965，P＜0.01），因此利用超微弱发光值来反映藜麦种子黄酮含量高低的方法是可行的，利用该技术可以快速、无损伤地对藜麦种子黄酮含量的高低进行初期筛选，为藜麦育种工作节省大量的人力、物力，加速育种进程。

藜麦；超微弱发光；黄酮

超微弱发光（UWL）是生命体在进行生命活动时的一种表现形式，与生物系统的氧化代谢、细胞分裂和死亡、病变以及生长调控等许多的基本过程有着内在的联系，特别是与生物机体内的生化生理和病理状态密切相关，能够灵敏地反映生物有机体的生理生化反应状态，近年来生物超弱发光的研究已成为生物学、农学和生物物理学等学科交叉领域的新生长点。在种子品质检测各种方法中，物理方法快速简便，对种子无损且用种量少[1]。它不仅对生命科学领域有重大的科学意义，同时也在农业、医学、食品和环境科学等领域具有很广泛的应用前景[2-4]。

作为生命过程的一个极其灵敏的指示器，UWL在植物种子活力检测、 植物抗逆性鉴定、果实品质无损检测等方面成为一种新的检测方法[5]。但是，有关UWL与植物种子品质的研究还未见报道。藜麦具有独特的、丰富全面的营养价值，在国际市场上有着良好的知名度，国内发展也非常迅速[6]，其富含黄酮，而黄酮可有效清除体内的氧自由基，降低胆固醇；传统方法对藜麦黄酮含量的测定耗时耗力，给育种工作带来巨大负担，而采用UWL方法进行黄酮含量的测定快速、简单，且对种子无损。本研究以山西省农科院生物中心本土化种植3年、农艺性状较好的的藜麦材料为研究对象，在进行超微弱发光研究的基础上测定其黄酮含量，通过研究二者之间的相关性，以期摸索出一条快速检测藜麦黄酮含量（或者综合品质）且不损伤样品的方法，为藜麦育种者初期进行藜麦优良材料的筛选提供一种快速、简便的方法，节省人力、物力，加速藜麦育种进程。

1 材料与方法

1.1 材料 选取山西省农科院生物中心本土化种植3年、农艺性状较好的3个藜麦品种（晋灰藜-1、晋红藜-1、晋黑藜-1）为供试材料，2015年在本中心实验室盆栽种植，每个品种30株，共90份材料，编号1～90。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线的绘制 本试验以芦丁作为藜麦总黄酮含量测定的标准品。准确称取在120℃干燥至恒重的芦丁标准品10mg，用70%的乙醇溶解并定容至100mL，使其浓度为100μ g/mL。将芦丁溶液用70%的乙醇稀释成0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μ g/mL，各取1mL于试管中，加70%的乙醇1mL和0.3mL 5%的NaNO2，混匀后放置6min，然后加入0.3mL 10%的Al（NO3）3溶液，摇匀后放置6min。最后再加入2mL 4%NaOH，摇匀，放置10min。在510nm处测定不同浓度的标准品的吸光值。

根据标准曲线的制作方法，以浓度（C，mg/mL）为纵坐标，吸光值（A，510nm）为横坐标，进行线性回归得到回归方程：C=0.1207A+0.0008，相关系数：R2=0.9998（图1）。

图1 芦丁标准曲线图

1.2.2 黄酮提取方法 藜麦种子黄酮的提取参考孙雪婷等[7]的方法。每份材料称取藜麦种子2g，用粉碎机充分粉碎后过0.5mm 孔筛筛选，装入干燥器皿中备用，分别精确称取藜麦面粉各1g于平底锥形瓶中（回流装置），锥形瓶中加入30mL 80%的乙醇，将锥形瓶放置于60℃的水浴锅中，浸泡提取60min。

1.2.3 总黄酮含量测定 取1mL提取液于25mL容量瓶中，按照标准曲线制作方法处理后用90%的乙醇定容至刻度。然后吸取适量黄酮提取液于石英比色杯中，510nm处测得吸光值A，计算总黄酮含量。

其中，W为藜麦粉重量（g），C为芦丁浓度（mg/g）。

1.2.4 藜麦种子的超微弱发光研究 各单株取子粒饱满的种子300粒，按随机取样的方法进行顺序测定，然后用超微弱发光仪测量其超微弱发光，所得数据以单株为单位求平均值。

测量仪器采用中国科学院生物物理所的BPCL-K超微弱发光分析仪。试验前将仪器预热1h，使本底稳定，灵敏度（高压）调至-1kV，温度控制在20±0.3℃，控制周围噪音，然后将样品置于样品室中暗适应200s后开始测量其自身发光强度。每次测量100s，间隔5s计数一次，记录光子总数，单个样品连续测量10次。每个样品测量前先测1次本底，用10次测量值的平均值减本底值作为自身发光强度的测量值。

1.3 数据处理和分析 数据处理采用生物学统计软件SPSS 18以及数据处理绘图工程软件Origin 8.0。

2 结果与分析

2.1 藜麦种子黄酮含量和超微弱发光综合对比 种子发出的光子数多少与种子内部的自由基浓度有关，自由基浓度越高，种子发出的光子数量也越多，而黄酮具有抗氧化的功能，能够清除自由基，藜麦种子内生物类黄酮含量的多少与自由基的浓度有着直接的关系，进而与藜麦种子发出的光子数量有关，由图2可以直观地看出：2组折线的同一组X（同一序号）值所对应的2组Y（黄酮含量、光子数）值，基本上都是波峰对应波谷，即黄酮含量较高的样品其超微弱发光值低，黄酮含量低的样品超微弱发光值较大。

图 2 藜麦种子黄酮含量与超微弱发光双坐标图

2.2 藜麦黄酮含量和超微弱发光的相关和显著性分析 生物类黄酮具有抗氧化功能，能够有效清除体内的自由基（Free Reaical）及毒素，而自由基复合反应是超微弱发光的主要来源之一，利用统计学规律，对藜麦种子内生物类黄酮的含量和藜麦种子的超微弱发光（与自由基浓度正相关）进行量化分析，对所得数据（黄酮含量、超微弱发光）进行Pearson（皮尔生）乘积矩相关系数分析，这是一个范围在-1.0～1.0 之间（包括-1.0 和1.0 在内）的无量纲指数，能够反映两个数据集合之间的线性相关程度。如果乘积矩相关系数r为正数，则说明这两组数据集合之间是正相关，如果乘积矩相关系数r为负数，则说明这两组数据集合之间是负相关。

Pearson（皮尔生）乘积矩相关系数r的公式为：

其中，x和y是样本平均值 AVERAGE（array1）和 AVERAGE（array2）。

对2组数据集合进行Pearson（皮尔生）乘积矩相关性分析可知，二者表现出极显著的负相关性（P=0.01，相关系数r=-0.956**），即藜麦黄酮含量越高，超微弱发光值越低；超微弱发光值越低，藜麦黄酮含量越高，该结果与图2直观结果基本一致。由此可以得出超微弱发光值可以作为反映藜麦种子黄酮含量（综合品质）的有效指标。

3 结论与讨论

黄酮能够阻断自由基链反应，因此种子黄酮类化合物的含量理论上与自由基的数量呈负相关，而自由基的数量与发出的光子数呈正相关，因此黄酮含量应该与发出的光子数呈负相关，本研究表明：藜麦种子的黄酮含量与其超微弱发光值呈极显著负相关性，因此通过超微弱发光技术对藜麦黄酮类化合物含量进行无损检测的方法是可行的。该技术可以解决藜麦常规育种过程中对藜麦黄酮含量的检测步骤繁琐、样品量大且比较耗时等问题。目前，国内外研究者主要集中在利用该技术对种子、果实等的生命活动强弱以及种子生长发育的检测方面开展研究，对种子的品质检测方面的研究比较少，本研究发现的超微弱发光检测法可以较为准确地反映藜麦种子黄酮含量，而且检测过程迅速、简单、对种子无损，一定程度上满足了快速无损检测的要求，但由于超微弱发光检测技术灵敏度较高，对周围环境的要求比较高，导致精确度不高，因此在应用的过程中需要综合考虑各种因素，以保证检测结果的真实性。今后，通过进一步增加样品的数量和样品的种类对该技术进一步进行验证和完善，同时运用多种物理手段进行检测，相互补充，以达到最终结果的准确、精确，使该技术在种子品质检测领域能够广泛的应用。

[1]于继洲，韩红艳，郭艳，等．种子检测技术研究进展[J]．中国种业，2005（2）：21-23

[2]李淑丽．生物超微弱发光研究进展[J]．激光杂志，2004（4）：4-6

[3]赵丹莹，生吉萍，丁洋，等．超微弱发光用于番茄果实冷害发生程度的无损监测[J]．光谱学与光谱分析，2010，30（9）：2493-2495

[4]田珊珊．猕猴桃成熟过程中超微弱发光的研究[D]．西安：西北大学，2007

[5]李友明．浅析超微弱发光分析技术在农业中的应用效应[J]．农业工程技术，2016（9）：64-65

[6]屈洋，王可珍，康军科．关中西部麦茬直播藜麦栽培技术[J]．中国种业，2016（1）：82

[7]孙雪婷，袁俊杰，蒋玉蓉，等．藜麦种子总黄酮提取及其抗氧化性[J]．江苏农业科学，2015，43（10）：355-358

2017-03-28）

山西省农业科学院博士基金（YBSJJ1611）；山西省农业科学院种业发展专项（2016zyzx51）；农业部黄土高原作物基因资源与种质创新重点实验室建设子项目；山西省农业科学院特色农业技术攻关项目（YGG17065）

秦永军