硫化氢对实验性高原肺水肿大鼠呼吸膜通透性的影响*

汪晓筠，刘春燕，张 欢，郭新建，张 伟△

(1.青海大学医学院；2.西宁市第三人民医院；3.陕西省渭南市中心医院； 4.青海大学附属医院)

硫化氢对实验性高原肺水肿大鼠呼吸膜通透性的影响*

汪晓筠1，刘春燕2，张 欢3，郭新建4，张 伟1△

(1.青海大学医学院；2.西宁市第三人民医院；3.陕西省渭南市中心医院； 4.青海大学附属医院)

目的 通过肺组织病理学观察及渗出液成分检测，探讨硫化氢(H2S)对实验性高原肺水肿大鼠呼吸膜通透性的影响。方法 健康成年雄性Wistar大鼠随机分为四组：常氧对照组、低氧对照组、试剂(PPG)常氧组、试剂(PPG)低氧组。用面罩低氧方式构建大鼠实验性高原肺水肿模型。用腹腔注射PPG抑制内源性H2S的产生。用ELISA法检测肺组织中EB含量和支气管肺泡灌洗液(BALF)中TP含量，光镜下观察肺组织的病理学改变。结果 PPG常氧组中BALF的TP含量明显高于常氧对照组(P<0.05)，PPG低氧组肺组织EB含量和BALF中TP含量明显高于低氧对照组和PPG常氧组(P<0.05)；镜下观察到PPG低氧组肺组织病理损伤最为严重，PPG常氧组较常氧对照组严重。结论 降低内源性H2S可增加实验性高原肺水肿大鼠肺呼吸膜通透性，导致蛋白质渗出增多；体内H2S的减少会加重低氧对肺呼吸膜的损伤。

高原肺水肿 硫化氢 肺呼吸膜通透性 大鼠

有学者认为，高原肺水肿(HAPE，high altitude pulmonary edema)的形成并非仅仅是肺动脉压力增高导致的漏出性水肿，而是同时伴有肺呼吸膜结构损伤，出现“大孔”性蛋白渗漏所致的低蛋白性水肿[1，2]。这种渗漏在应用激素及细胞因子抑制剂后并不能有效地抑制其蛋白漏出、减轻肺水形成和改善预后[3]。

硫化氢(H2S)是迄今发现的惟一的内源性血管平滑肌K[ATP]通道开放剂，可缓解和改善低氧性肺动脉压力增高[4]；同时H2S具有抗炎和抗氧化作用[5]。由此推测H2S可能参与了HAPE发生的病理生理过程，但目前未见相关报道。

本研究拟采用H2S生成限速酶抑制剂炔丙基甘氨酸(propargyl glycine，PPG)减少内源性的H2S产生，通过肺组织病理学观察及渗出液成分检测，探讨H2S对实验性高原肺水肿大鼠呼吸膜通透性的影响，为阐释H2S防治HAPE的药物作用靶点提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料选择

健康成年雄性Wistar大鼠72只，体重(300±20)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：SCXK(京)2012-0001，NO.11400700064575]，选用维持饲料(北京科澳协力饲料有限公司)饲养。

PowerLab生物采集系统(AD Instruments，Australia)，动物体温维持系统(154 Huron Avenue Clifton，NJ07013 USA)；聚乙烯导管(医用无毒级别，夏目制作所，东京，日本)，总蛋白(TP)含量测定试剂盒(美国R&D公司)；甲酰胺溶液、肝素粉、伊文思蓝粉(EB)、炔丙基甘氨酸(美国sigma化学公司)。

1.2 动物分组与处理

大鼠随机分为四组，常氧对照组(normoxia group)：予常氧(O2含量为21%)30 min；低氧对照组(hypoxia group)：予面罩低氧(O2含量为12%，CO2为3.0%)，30 min；PPG常氧组(PPG normoxia group)：术前2 h予3.75% PPG溶液(37.5mg·kg-1，i.p.)[6]，常氧30 min；PPG低氧组(PPG hypoxia group)：上述PPG处理后，予低氧30 min。每组大鼠分别检测肺组织EB含量、BALF(支气管肺泡灌洗液)成分并行肺组织形态学观察。

大鼠术前禁食过夜，用2.5%戊巴比妥钠(50mg·kg-1，i.p.)麻醉，仰卧位固定，用动物体温维持系统保持大鼠体温(恒定在37℃)。颈前正中切口，分离右侧颈外静脉，用聚乙烯导管(0.58mm×0.96mm)插入右侧颈外静脉，在PowerLab生物采集系统监测下，逐步将导管送入右心室，确定出现稳定的右心室压力波型后固定导管。

1.3 大鼠肺组织EB含量测定

每组大鼠随机取6只，根据上述分组处理30 min后，经连接聚乙烯导管的三通管注射2%EB(20mg·kg-1)入右心室，5 min后开胸取左下肺组织，称取1 g，吸干血液，将其剪成约10 mm2小块，按每100 mg湿重组织用2 mL甲酰胺比例浸泡，置60 ℃恒温水浴中抽提24 h，离心(1500r/min，10min)取上清液，在标准曲线相同的条件下，用紫外分光光度计在620 nm波长处进行比色测定光密度值，通过标准曲线计算出EB含量，以每克肺组织干重含EB质量表示。

1.4 BALF中TP含量的测定

每组大鼠随机取6只，根据上述分组处理30 min后，从腹主动脉放血使大鼠处于失血性休克状态后迅速行气管插管，将37 ℃无菌生理盐水2 mL缓慢注入肺内，间隔30 s后将其抽回，如此进行3次，回收率>60%。BALF中TP含量检测严格按照ELISA试剂盒说明书操作。

1.5 肺组织形态学观察

每组大鼠随机取6只，根据上述分组处理30 min后开胸，剪开左心耳；行气管插管，连接空气泵，压力维持在20 cmH2O左右，将左右肺叶吹起，再经连接聚乙烯导管的三通管首先向右心室注入生理盐水，经肺循环从左心耳将血液冲出，待灌注至流出液清亮后再注入10%的福尔马林溶液灌注固定。取右下肺叶，用10%福尔马林固定，由专业人员做病理切片、HE染色，光镜下观察肺组织病理学变化。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 H2S对实验性HAPE大鼠肺组织中EB含量和BALF中TP含量的影响(表1)

表1 大鼠肺组织中EB含量和BALF中TP含量的变化(n=6)

Table 1 Table 1 Changes of EB content in lung tissue and TP content in BALF of rats(n=6)

▲：与常氧对照组比较P<0.05；※：与低氧对照组比较P<0.05；★：与PPG常氧组比较P<0.05.

表1显示，常氧对照组肺组织中EB含量明显低于低氧对照组(P<0.05)，而PPG低氧组明显高于低氧对照组和PPG常氧组(P<0.05)；常氧对照组BALF中TP含量明显低于低氧对照组和PPG常氧组(P<0.05)；而PPG低氧组明显高于低氧对照组和PPG常氧组(P<0.05)，提示体内H2S浓度降低可增加肺呼吸膜的通透性，使蛋白质渗出增加。

2.2 H2S对实验性HAPE大鼠肺组织形态的影响(图1)

A：常氧对照组 B：PPG常氧组 C：低氧对照组 D：PPG低氧组

图1显示，常氧对照组大鼠肺泡腔结构均匀，腔内无渗出液，肺泡隔纤细，无明显炎细胞浸润(图A)；PPG常氧组大鼠部分肺泡腔内见渗出液，肺泡隔厚度略增宽，内有少量淋巴细胞和中性粒细胞浸润(图B)；低氧对照组大鼠肺泡腔内见多少不等的渗出液，肺泡隔厚度增宽，内有少量淋巴细胞和中性粒细胞浸润(图C)；PPG低氧组大鼠肺泡腔内见多少不等的渗出液，肺泡隔厚度明显增宽， 肺泡隔内毛细血管充血，内皮细胞肿胀，内有大量淋巴细胞和中性粒细胞浸润(图D)。

3 讨论

本研究通过面罩低氧的方式构建大鼠实验性HAPE模型，采用检测肺组织中EB含量和BALF中TP含量作为评价肺呼吸膜通透性的指标。结果显示，低氧对照组肺组织EB含量及BALF中 TP含量均较常氧对照组明显升高(P<0.05)，光镜下观察到低氧对照组肺泡腔内见渗出液，肺泡隔厚度增宽等，提示面罩低氧造成了大鼠肺呼吸膜通透性增加，组织液渗出增多，证明大鼠实验性HAPE模型构建成功。

腹腔注射PPG减少了内源性H2S的产生后，结果显示PPG常氧组中BALF的TP含量明显高于常氧对照组(P<0.05)，镜下观察到PPG常氧组大鼠肺组织病理损伤较常氧对照组严重，提示降低体内H2S浓度可影响肺呼吸膜通透性，导致蛋白质渗出增多。同时，PPG低氧组肺组织EB含量和BALF中TP含量均明显高于低氧对照组和PPG常氧组(P<0.05)，镜下观察PPG低氧组大鼠肺组织病理损伤最严重，提示体内H2S浓度降低可加重低氧对肺呼吸膜结构的损伤。研究显示[7]，低氧可导致机体CSE/H2S系统下调，从而使大鼠内源性H2S产生减少。分析低氧与PPG联合使肺呼吸膜结构损伤加重的原因—可能与体内H2S浓度进一步降低有关。

急进高原后，机体突然面对低压低氧环境，可快速产生各种应激反应。一方面急性低氧时细胞内ATP不足，使血管平滑肌细胞上K[ATP]处于关闭状态，导致低氧性肺血管收缩反应(HPV，hypooxygen pulmonary vasculation)[8]。同时，机体释放大量缩血管因子[9]加重肺血管收缩，导致肺动脉压力增高，肺毛细血管血压增高，当它超过肺血浆胶体渗透压时，即可使组织液漏出至肺间质甚至肺泡腔内；另一方面低氧状态下自由基的产生与清除失平衡，可导致细胞膜的结构和功能损伤，同时低氧直接诱导内皮细胞中细胞黏附分子(如ICAM-1、E-selectin 等)基因的转录激活，增强血管内皮细胞和炎症细胞的相互作用，在肺血管周围形成促炎微环境，增加炎症因子(如Annexin A1、TNF-α、MCP1、IL-6 等)的表达，进一步介导或促进肺血管收缩乃至肺血管结构改建[10、11]，致肺呼吸膜结构损伤，通透性增加，使液体、蛋白质乃至血液等有形成分渗出。

H2S是内源性血管平滑肌K[ATP]通道开放剂， 通过兴奋K[ATP]通道、增加细胞内K+的外流，抑制Ca2+内流，使细胞膜出现超级化，进而介导血管平滑肌舒张，从而缓解和改善低氧性肺动脉压力增高[4]；同时，H2S可以减少TNF-α的产生，抑制MCP-1的集聚，上调白细胞介素10等抗炎介质的表达，还可以提高ROS的清除能力，降低MDA水平，发挥抗炎、抗氧化作用[5]，从而降低肺呼吸膜的损伤。综上所述，H2S可通过改善低氧应激下肺动脉压力和呼吸膜通透性等机制缓解HAPE的发生和发展。

本研究中低氧或腹腔注射PPG处理，均可减少内源性H2S的生成，结果表明体内H2S降低可增加肺呼吸膜通透性，导致蛋白质渗出增多；而且从组织形态观察到H2S的减少会加重低氧对肺呼吸膜的损伤作用。从反向思维的角度佐证了H2S对HAPE的发生和发展具有保护作用。由此推测，急进高原时通过药物或其他途径降低机体H2S下降速度，可能会预防和改善HAPE的发生，其机制有待进一步研究明确。

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Effect of Hydrogen Sulfide on Pulmonary Respiratory Membrane Permeability in Rats with Experimental High Altitude Pulmonary Edema*

WANG Xiao-jun1，LIU Chun-yan2，ZHANG Huan3，GUO Xin-jian4，ZHANG Wei1△

(1.Medical College of Qinghai University；2.The Third People′s Hospital of Xining City，Qinghai Province； 3.Weinan Central Hospital of Shanxi Province；4.Affiliated Hospital of Qinghai University)

Objective To investigate the effect of hydrogen sulfide on pulmonary respiratory membrane permeability in rats with experimental high altitude pulmonary edema by detecting lung histopathology and the composition of pulmonary effusion fluid.Methods Healthy adult male Wistar rats were randomly divided into 4 groups：normoxia group，hypoxia group，PPG normoxia group and PPG hypoxia group.The models of rat with experimental high altitude pulmonary edema were established by hypoxic mask，the concentration of H2S in vivo was reduced by intraperitoneal injection of PPG.The contents of total protein(TP)in broncho alveolar lavage fluid(BALF)and the Evans blue(EB)in lung tissue were measured by ELISA.The pathological changes of lung tissue were observed under light microscope.Results The content of TP in BALF in PPG normoxia group was significantly higher than those in normoxia group(P<0.05).The content of TP in BALF and the EB in lung tissue of PPG hypoxia group were significantly higher than those in hypoxia group and PPG normoxia group(P<0.05).The pathological lesion in PPG normoxia group was more serious than those in normoxia group，and the pathological lesion in PPG hypoxia group was the most serious.Conclusion The decrease of H2S concentration could increase the pulmonary respiratory membrane permeability and lead to the increase of protein excretion.Meanwhile the reduction of H2S could aggravate the damage of pulmonary respiratory membrane permeability in hypoxia.

High Altitude Pulmonary Edema Hydrogen sulfide Pulmonary respiratory membrane permeability Rat

*：国家自然科学基金项目(NO.81560301)；教育部新世纪优秀人才项目(NCET-12-1022)；归国留学人员择优项目(青人社厅函[2015]522号)；青海大学中青年科学基金项目(2013-QYY-3)；青海大学医学院中青年团队项目(2013-KT-4) 汪晓筠(1971～)，女，满族，山东籍，硕士，副教授；△：通信作者，博导，教授，zw0228@sina.com

R363

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2017.02.003

2017-01-09