杀菌剂室内空白菌量检测方法研究

高胜华

中国石化中原油田分公司技术监测中心化工产品监测总站（河南濮阳457001）

杀菌剂室内空白菌量检测方法研究

高胜华

中国石化中原油田分公司技术监测中心化工产品监测总站（河南濮阳457001）

在依据标准Q/SH 0355—2010《油田采出水处理用杀菌剂技术要求》对杀菌剂产品质量进行检测时，采出水空白菌量室内培养及计数是检测的重要环节。分析了培养基加入量、培养时间及培养温度对培养空白细菌菌量的影响，优化选择培养基体积分数为0.20%、培养温度为（40±5）℃、培养时间为36h，作为培养空白菌量最佳实验条件。针对不同标准对菌量计数方法的不同要求而导致的结果偏差问题，从理论和实验角度进行分析验证，通过对空白菌量室内检测及计数的方法优化，确定绝迹稀释法为最合理计数方法，从而提高了室内杀菌效果检测结果的准确性和时效性，对油田用杀菌剂的质量检测工作有一定的指导意义。

杀菌剂；室内杀菌效果；细菌培养；绝迹稀释法

油田采出水中含有大量的有机质且含氧量低，为细菌特别是厌氧菌的繁殖生长提供了有利条件，其中危害最大的是硫酸盐还原菌（SRB）、腐生菌（TGB）、铁细菌（FB），细菌在注水系统中大量繁殖，危害水质、造成腐蚀、堵塞油层，给油田生产造成巨大经济损失[1-3]，这就需要在水体中加入一定量的杀菌剂进行预处理。杀菌剂通过影响细菌正常的新陈代谢而起杀菌作用，是一种能杀死或抑制各种微生物的化学产品药剂[4-6]。因此准确及时地检测控制杀菌剂质量至关重要。

室内杀菌效果是评价杀菌剂质量的一项重要指标，现行的行业标准和各油田企业内部标准大多采用绝迹稀释法[7-8]来评价室内杀菌效果，中原油田采用标准Q/SH 0355—2010《油田采出水处理用杀菌剂技术要求》检测杀菌剂室内杀菌效果。标准规定，取回的水样若因故放置超出24h，这就需要向水样中加入营养基进行空白细菌培养，在实际检测工作中发现：①由于选择不同实验条件，培养出的细菌菌量不同，造成杀菌效果检测结果出现偏差，影响室内杀菌效果的评价；②标准规定采用2次重复法进行空白实验，不同的检测人员对多组测试瓶细菌计数采用的方法不同及确定成长指数的原则理解层次偏差，造成细菌计量的差异，影响室内杀菌效果的判断[9]。因此，优化培养采出水空白菌量的室内评价及计数方法，能够进一步提高检测结果的准确性，减少实验的重复性，及时准确地评价杀菌剂质量[10]。

1 实验部分

1.1 仪器及材料

DHP—9272型恒温培养箱、电热压力蒸汽消毒器、细菌培养瓶（SRB）、1 mL一次性灭菌注射器、350 mL玻璃菌瓶。

1.2 实验用水样的要求

1）实验用水样取自污水站未经杀菌剂处理的水。

2）水样应在采集后24h之内尽快进行杀菌效果实验。如因故不能在24h内回到实验室进行检验，则在水样中加入营养基培养24～72h进行测试，营养基加入量推荐为0.1%～0.2%，污水中细菌的最佳生长温度一般为30～50℃。

1.3 实验步骤

1）空白实验采用2次重复法。

2）抽取空白水样于密闭玻璃菌瓶中，抽取的水量满足实验要求，放入恒温培养箱选择所需的培养温度进行培养。

3）培养一定时间后，将10个细菌培养瓶排成一组并依次编号，用一次性灭菌注射器取空白水样1.0mL注入1#培养瓶，充分震荡，再从1#培养瓶抽取1.0mL水样注入2#培养瓶中，依次类推，直至稀释到第10个培养瓶为止，同理再做一组。

4）将实验培养瓶放置于恒温培养箱，恒温培养7天后，观察细菌瓶中细菌生长的情况，根据细菌生长情况和稀释倍数，计算出水样中细菌的数目。

2 结果与讨论

2.1 水样放置时间对菌量的影响

取回的现场采出水随着放置时间的延长，水中的细菌量不断变化。放置时间越长，水中环境的改变导致细菌量变化较大见表1。尤其是温度的影响，当温度高于水中细菌生长的适宜温度，会导致细菌死亡；当温度低于适宜温度，会抑制细菌的生长甚至死亡。因此从现场取回的水样要在30～50℃环境中放置，并尽快在24h内检测，如果放置时间超过24h，应加入培养基在适宜的条件下进行细菌培养。

表1 水样放置时间对SRB细菌影响数据统计表/(个·mL-1)

2.2 温度对实验室培养细菌的影响

取现场水配制体积分数为0.2%SRB培养基，根据污水中细菌的最佳生长温度为30～50℃，选取30、35、40、45、50℃进行绝迹细菌培养，统计数据见表2。

表2 温度对实验室培养SRB细菌影响数据统计/(个·mL-1)

由表2看出：在温度30～50℃之间进行细菌培养，随着温度的变化，细菌的生长菌量趋于稳定。

根据标准Q/SH 0355—2010《油田采出水处理用杀菌剂技术要求》对水温的要求，选择（40±5）℃为培养细菌的最佳培养温度。如现场施工对温度有要求，则优选现场温度进行细菌培养。

因此，在冬季取水样过程中要对水样瓶进行适当保温，改进取水样装置，在水样瓶的外壁裹了一层橡塑板，用以保温，并用不透明非活性玻璃瓶代替以往的塑料桶，防止水样中细菌吸附，减少了检测误差。

2.3 培养时间对细菌菌量的影响

由表2看出随着培养时间的延长，细菌菌量不断增大。当培养时间在36h时，产生的细菌数量满足标准对空白的要求。同时检测1个杀菌剂样品需要7天时间，培养时间过长势必会影响检测效率，造成人力、物力的浪费，因此选择最佳培养时间为36h。

2.4 培养基的加入量对细菌菌量的影响

在加入的培养基浓度很低情况下，培养基浓度影响细菌的生长速度，随着培养基浓度的提高，生长速度趋于稳定；进一步提高培养基浓度，生长菌量增大，而且随着培养基浓度过大会发生菌体菌量富集程度过高现象[11]。

将6个350 mL的玻璃菌瓶，用采出水配制体积分数为0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.50% SRB培养基，将实验培养瓶放入恒温箱中，在45℃情况下恒温36h，用绝迹稀释法检测0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.50%SRB细菌培养，7天后读取细菌的生长个数（表3）。

表3 实验室培养SRB细菌生长数据统计

由表3可以看出：当加入的培养基的体积分数为0.15%时，细菌的菌量就能满足标准对空白菌量的要求，采出水处于随时变化中，因此应放宽一个级别，选择体积分数为0.20%。

2.5 选择合理菌量计数方法

细菌培养7天后读取细菌的生长个数，目前有两种方法计算细菌菌量，第1种方法是标准Q/SH 0355—2010《油田采出水处理用杀菌剂技术要求》中推荐的“菌量计数按SY/T 5329—2012中5.6.5条规定读数”；第2种方法是根据SY/T 0532—2012《油田注入水细菌分析方法绝迹稀释法》进行多组测试瓶细菌计数，现对两种方法进行现场试验分析，具体见表4～表5。

表4 1701#污水细菌生长情况（二次重复法）

表5 1707#污水细菌生长情况（二次重复法）

由表4看出，按第1种方法得出水样中指数为“211”，查SY/T 5329—2012标准中二次重复法数据表得细菌数为13.0个/mL，再乘以指数第一位的稀释倍数101，即得含菌量为130个/mL。按第2种方法得出水样中指数为“110”，查SY/T 5329—2012标准中二次重复法数据表得细菌数为1.3个/mL，再乘以指数稀释倍数102，即得水样含菌量为130个/mL。结果：第1种方法与第2种方法计算的水样细菌含量一致。

由表5看出，按第1种方法得出水样中指数为“211”，查SY/T 5329—2012标准中二次重复法数据表得细菌数为13.0个/mL，再乘以指数第一位的稀释倍数101，即得水样含菌量为130个/mL。按第2种方法得出水样中指数为“111”，查SY/T 5329—2012标准中二次重复法数据表得细菌数为2.0个/mL，再乘以指数稀释倍数102，即得水样含菌量为200个/mL。结果：第1种方法与第2种方法计算的水样细菌含量相差70个/mL。

扩展到三次重复法计算菌数，见表6。

表6 1714#污水细菌生长情况（三次重复法）

由表6看出，按第1种方法得出水样中指数为“320”，查SY/T 5329—2012标准中三次重复法数据表得细菌数为9.5个/mL，再乘以指数第一位的稀释倍数101，即得水样含菌量为95个/mL。按第2种方法得出水样中指数为“200”，查SY/T 5329—2012标准中三次重复法数据表得细菌数为0.9个/mL，再乘以指数稀释倍数102，即得水样含菌量为90个/mL。结果：第1种方法与第2种方法计算的水样细菌含量相差5个/mL。

从表5和表6可以看出，两种计算细菌个数的方法存在不一致的情况，而生长指标所选的3级稀释倍数，共有6个或9个细菌测试瓶。从定性分析的角度来说，将这些细菌瓶可分为两类：一类是有细菌生长的阳性瓶，另一类是无细菌生长阴性瓶。从定量分析的角度来说，阳性瓶中有多少个细菌，不能加以量化，而阴性瓶里无细菌即0个/mL，可以加以量化，因此由阳性瓶推导的结果是不准确的，由阴性瓶推导的结果为准确结果[12]。

由表5看出：方法1中所选6个细菌测试瓶中有4个阳性瓶，2个阴性瓶；方法2所选的6个细菌测试瓶中有3个阳性瓶，3个阴性瓶。由表6看出：方法1中所选9个细菌测试瓶中有5个阳性瓶，4个阴性瓶；方法2所选的9个细菌测试瓶中有2个阳性瓶，7个阴性瓶。可见依据方法2所推导的结果比方法1更准确些，能够更接近实际的真实情况，而方法1得出的结果误差较大。因此细菌菌量的计算应依据SY/T 0532—2012《油田注入水细菌分析方法绝迹稀释法》标准中多组测试瓶细菌计数原则进行确定。

2.6 验证实验

取两批次的杀菌剂产品，用采出水进行检测杀菌剂的技术指标室内杀菌效果。第1种方法：在24h内尽快检测。第2种方法：将放置时间超出24h的水样，按加入培养基的体积分数为0.20%、培养温度为45℃、培养时间为36h，先培养空白细菌量，再进行检测。空白细菌菌量结果的读数依据SY/T 0532—2012《油田注入水细菌分析方法绝迹稀释法》中多组测试瓶细菌计数的原则。室内杀菌效果结果的判定依据标准Q/SH 0355—2010《油田采出水处理用杀菌剂技术要求》中技术指标的要求，结果见表7。

表7 检测SRB细菌室内杀菌效果数据

从表7得知样品在24h内与24h后的杀菌效果基本一致，结果在误差的范围内，符合标准的要求。

3 结论

1）通过对培养空白细菌菌量的检测方法影响因素分析，选择加入培养基的体积分数为0.20%、培养温度为（40±5）℃、培养时间为36h，作为培养空白菌量最佳实验条件。

2）对两种计数细菌菌量的方法进行理论与实际应用分析，得出SY/T 0532—2012《油田注入水细菌分析方法绝迹稀释法》中多组测试瓶细菌计数的原则方法是最合理的细菌菌量的计数方法。

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In the quality detection of bactericide products according to the standard Q/SH 0355-2010"technical requirements for bactericide for oilfield produced water treatment",the laboratory culture and counting of the bacteria in the bactericide blank sample of oilfield produced water is important link.The effects of culture medium amount,culture time and culture temperature on the amount of bacteria in blank sample were analyzed,and the optimum bacterium culture conditions were determined：the volume fraction of culture medium is 0.2%,the culture temperature is(40+5)℃,and the culture time is 36 h.It is theoretically analyzed and experimentally verified that different requirements of different standards to bacterial count method lead to the difference in the bacterial count results.Through the optimization of the laboratory bacterium detection and counting methods,it is held that extinction dilution method is the most reasonable bacterium counting method,which improves the accuracy and timeliness of the laboratory sterilization effect detection results of bactericides.The research result in this paper has certain guiding significance of quality inspection of bactericides.

bactericide;laboratory bactericidal effect;bacterial culture;extinction dilution method

左学敏

2017-02-09

高胜华（1970-），女，工程师，主要从事油田化学剂的质量监督检验与研究工作。