风味蛋白酶和中性蛋白酶复合酶解大豆分离蛋白制备多肽的研究

马诗文，高 云，吴金龙，郝晓亮

(辽宁科技大学化学工程学院，辽宁 鞍山 114051)



风味蛋白酶和中性蛋白酶复合酶解大豆分离蛋白制备多肽的研究

马诗文，高 云，吴金龙，郝晓亮

(辽宁科技大学化学工程学院，辽宁 鞍山 114051)

为了改善大豆蛋白的功能性质，使其在食品工业中有更广泛的应用，用酶来水解大豆蛋白，可以提高大豆多肽的产率。本研究以大豆分离蛋白作为底物，配制不同浓度的大豆分离蛋白溶液，经预处理后，用风味蛋白酶、中性蛋白酶进行酶解，得出两种酶的酶解最佳条件，即大豆分离蛋白溶液质量分数为4%、风味蛋白酶和中性蛋白酶比例为3∶1，pH值为7.5、酶解温度为45℃、酶解时间为7 h。在此条件下，溶液的水解度最高，经测定多肽含量为5.162%。

大豆分离蛋白；水解度；酶；多肽

大豆蛋白是国际上公认的较理想的植物蛋白质。多肽克服了大豆蛋白在营养学上的弱点，具有比大豆蛋白更丰富的营养和功能特性。大豆多肽已经成为有效的辅助制剂，在发酵工业中，大豆多肽可以作为微生物的营养源，促进微生物生长和代谢；在食品工业中，大豆多肽可以应用于焙烤食品、糖果糕点和冷饮食品中，既降低了成本，也改善了产品的风味、口感和组织状态等。目前制备大豆多肽的方法主要有微生物发酵法和酶解法，酶解法有单酶水解法、双酶水解法以及复合酶酶解等方法。随着研究的深入，人们逐渐认识到单酶水解法的不足，多酶复合水解法渐渐成为了研究的重点，且制得的产品性能普遍高于单酶水解法[1-4]。

本实验采用大豆分离蛋白为原料，配成大豆分离蛋白溶液，用酶水解生成大豆多肽。风味蛋白酶和中性蛋白酶均为水解大豆蛋白的常见酶，多数研究只针对于两种酶的单独水解，对于这两种酶的复配水解，相关的报道并不多。本研究将风味蛋白酶和中性蛋白酶进行复配，同时通过两种酶的复配来比较酶的复配和单一酶对大豆分离蛋白作用的差异，寻求两种酶的最佳配比。通过正交实验设计，综合比较选出大豆多肽最佳生产工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白(哈高科大豆有限责任公司，蛋白质质量分数为85.39%)；风味蛋白酶及中性蛋白酶(天津市诺奥科技发展有限公司，酶活分别为1.839 Ug/ml，2.352 Ug/ml)；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DDY-2A凯式定氮仪，JA2003A电子天平，PHSJ-3F实验室pH计，DHZ-9240型电热恒温鼓风干燥箱，S212恒速搅拌器，722S可见分光光度计，HH-8数显恒温水浴锅。

1.3 大豆分离蛋白酶解工艺[5-9]

大豆分离蛋白→85℃保温15 min→冷却到酶适宜的温度→调节pH值→放入水浴锅中，调节温度→加入水解所需的酶→水解适当的时间→取出酶解液迅速升温到90℃并保持20 min灭酶→冷却→4 000 r/min离心15 min→提取上清液→装瓶冷藏备用。

1.4 水解度的测定

采用甲醛滴定法测定蛋白质的水解度[10-11]。取大豆分离蛋白水解液2 ml于锥形瓶中，分别加入20 ml水，加入甲基红指示剂3滴，用0.05 mol/L NaOH滴至橙黄色，加入40%中性甲醛溶液5 ml，加入酚酞指示剂3滴，再用0.05 mol/L NaOH滴至橙黄色,并记下用量V1。

将大豆分离蛋白用6 mol/L HCl，100℃水解2 h，使蛋白质彻底水解。用上述方法测定，记下用去的0.05 mol/L NaOH的用量V2。

1.5 多肽含量的测定方法[12]

在酶解液中加入酸，调至蛋白质的等电点，经离心后，沉淀下来的是蛋白质，而多肽及少量的氨基酸仍留在溶液中，由Folin-酚法测出上清液中的多肽含量。

2 结果与分析

2.1 单因素对酶解反应的影响

2.1.1 风味蛋白酶和中性蛋白酶的比例对酶解反应的影响

通过预实验得知，在风味蛋白酶和中性蛋白酶进行复配时，风味蛋白酶起主要作用，因此，在做进一步实验时加入了更多的风味蛋白酶以提高酶解效果。在前期研究中，笔者重点考察了底物质量分数对大豆分离蛋白酶解的影响，最终认为4%的底物质量分数对于水解是比较有利的，这与其他文献报道的底物质量分数是一致的[13-14]。在底物质量分数为4%、温度为45℃、时间为7 h、pH值为7.0时，取风味蛋白酶和中性蛋白酶比例为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1来考查复合酶配比对水解度的影响。由表1数据可知，当风味蛋白酶和中性蛋白酶的比例选取3∶1时，能取得较好的酶解效果。

表1 不同复合酶配比酶解的水解度值

2.1.2 pH值对酶解反应的影响

在底物质量分数为4%、温度为45℃、时间为7 h的条件下，pH值调节为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的情况下进行水解，完成后测定水解度见表2：

表2 不同pH值酶解的水解度值

由表2数据可以看出，水解度的值会随着pH值的变化而不同，当处于碱性的时候，水解度会下降。两种酶在pH值为7.0的时候，水解度较高，说明水解效果好。可能是因为风味酶和中性酶等电点均在7.0左右，当pH值偏离了其等电点，在碱性条件下，溶液中多余的氢氧根离子可能会抑制水解反应的发生，影响酶对蛋白质的水解效果。

2.1.3 温度对酶解反应的影响

用风味蛋白酶、中性蛋白酶对大豆分离蛋白进行水解，在底物质量分数为4%、时间为7 h、pH值为7.0的条件下，调节酶解温度为40、45、50、55、60℃，测定水解度。

由表3可以看出，水解度的值会随着温度的变化有不同，过低的温度使酶和蛋白质的结合位点没有被激活，不利于水解；过高的温度会使酶变性，变性后的酶活性丧失，无法使蛋白质水解。根据实验数据可知，两种酶在温度为45℃的时候，水解度相对较高。

表3 不同温度酶解的水解度值

2.1.4 酶解时间对酶解反应的影响

用风味蛋白酶、中性蛋白酶两种酶对大豆分离蛋白进行水解，在底物质量分数为4%、温度为45℃、pH值为7.0的条件下，水解1、3、5、7、9、11 h，水解完成后测定水解度。水解度的值会随着时间的延长而增大，但是当蛋白质底物逐渐消耗殆尽，酶对蛋白质的水解停止。如表4所示，当时间为7 h时，水解已经较完全。

表4 不同时间酶解的水解度值

2.2 双酶复合法正交试验

双酶水解大豆分离蛋白正交试验结果见表5。

表5 双酶水解大豆分离蛋白正交试验结果

由表5可知，各个因素对酶水解度影响从大到小为:酶解时间、酶解温度、复合酶配比、pH值。双酶酶解大豆分离蛋白的最佳工艺条件是A3B3C2D2。进行验证实验，选取风味蛋白酶和中性蛋白酶比例为3∶1，pH值为7.5、酶解温度为45℃、酶解时间为7 h，得到的水解度为60.42%，高于正交实验中的各条件下的水解，故此水解条件为最优。

3 结论

通过单因素及正交实验法确定双酶酶解大豆分离蛋白的最佳工艺条件是底物质量分数为4%、风味蛋白酶和中性蛋白酶比例为3∶1，pH值为7.5、酶解温度为45℃、酶解时间为7 h，此时得到的溶液水解度最高，经测定多肽质量分数为5.162%，酶解后的大豆分离蛋白具有优良的特性，可以进一步应用到食品工业中。

[1] 周利亘,陈新峰,王君虹,等.大豆多肽复合酶解工艺条件研究[J].食品科技,2005,22(7)：22-25.

[2] 肖怀秋,李玉珍,兰立新.大豆分离蛋白的酶法水解研究[J].中国食品添加剂,2007(3):77-81.

[3] 肖怀秋,李玉珍,兰立新,等.大豆分离蛋白酶法改性研究进展[J].酿酒,2007,34(5):50-52.

[4] 程云龙,管军军,李世豪.酶法改性大豆分离蛋白最新研究进展[J].粮食与饲料工业,2015(3):20-27.

[5] 吴建中,赵谋明,宁正祥,等.双酶法生产低苦味大豆多肽研究[J].食品工业科技,2003,4:24-27.

[6] 愈建瑛,蒋 宇,王善利.生物化学实验技术[M].北京：化学工业出版社,163-170.

[7] 周利亘,王君虹,陈新峰,等.三酶复合法提取大豆多肽工艺的研究[J].浙江农业学报,2006,18(4):241-245.

[8] 蔡高峰,黄纪念,孙 强,等.大豆降压肽酶解制备工艺的优化研究[J].粮食与饲料工业,2013(3):26-29.

[9] 张 毅,华欲飞,孔祥珍,等.酶解制备高得率大豆肽工艺条件优化[J].粮食与饲料工业,2009(11):16-19.

[10] 郭兴凤.蛋白质水解度的测定[J].中国油脂,2000,25(6):116-117.

[11] 徐 勤,葛向阳,刘建峰.甲醛法测大豆蛋白水解度的改进[J].饮料工业,2008,29(5):46-47.

[12] 陈毓荃.生物化学试验方法和技术[M].北京：科学出版社，2002：164-166.

[13] 胡少新,江连洲,许德春,等.大豆分离蛋白生产降血压肽酶解技术研究[J].大豆科学,2011,30(4)：643-647.

[14] 黄建韶,张 洪,赵东海.Alcalase蛋白酶水解大豆分离蛋白的研究[J].安徽农业科学,2010,38(9)：4 804-4 806.

(责任编辑：赵琳琳)

Preparation of polypeptide by cohydrolysis of soybean protein isolated with flavor protease and neutral protease

MA Shi-wen,GAO Yun,WU Jin-long,HAO Xiao-liang

(College of Chemical Engineering, University of Science and Technology LiaoNing, Anshan 114051, China )

In order to improve the functional properties of soybean protein and make it have more extensive application in food industry, the enzyme was used to hydrolyse soybean protein, which could improve the yield of soybean peptides. Using soybean protein isolated as the substrates, different concentrations solutions of soybean protein isolated were prepared, after pretreatment, flavor protease and neutral protease were digested with the solution, the optimum condition were acquired as:the solution concentration of soybean protein isolated was 4%, the ratio of flavor protease and neutral protease was 3∶1, the pH value was 7.5, the enzymolysis temperature was 45℃, the enzymolysis time was 7 h. Under this condition, the degree of hydrolysis of the solution was the highest, the polypeptide content was 5.162% by the experiment.

soybean protein isolated; degree of hydrolysis; enzyme; polypeptide

2017-02-04；

2017-06-23

辽宁省大学生创新创业训练计划项目(201410146000035)；辽宁省普通高等学校本科教育教学改革研究项目(UPRP20140453；2016-145)；辽宁省高等教育研究“十三五”规划课题(课题编号：GHYB160159)；2016年辽宁科技大学大学生创新创业训练计划项目(DC2016124)。

马诗文(1995-)，女，本科，专业方向为食品生物技术。

郝晓亮(1980-)，男，讲师，博士，研究方向为生物制药及食品生物技术。

10.7633/j.issn.1003-6202.2017.07.011

TS201.2+1;TS 201.2+5

A

1003-6202(2017)07-0043-03