依诺肝素钠树脂脱色工艺研究

李 宁，张静岩，任风芝，张雪霞，刘建芬

(1.华北制药集团新药研究开发有限责任公司 微生物药物国家工程研究中心 河北省工业微生物药物代谢工程技术中心，河北 石家庄 050015；2.华北制药华坤河北生物技术有限公司，河北 石家庄 050000)



依诺肝素钠树脂脱色工艺研究

李 宁1，张静岩1，任风芝1，张雪霞1，刘建芬2*

(1.华北制药集团新药研究开发有限责任公司 微生物药物国家工程研究中心 河北省工业微生物药物代谢工程技术中心，河北 石家庄 050015；2.华北制药华坤河北生物技术有限公司，河北 石家庄 050000)

采用脱色树脂，对依诺肝素钠进行了脱色工艺研究，以脱色率和脱色收率为考核指标，考察了树脂型号、脱色液pH值、脱色液浓度、脱色前依诺肝素钠与树脂质量比、脱色液流速对脱色效果的影响。得到最优的脱色工艺：使用DOWEX OPTIPORE SD-2树脂，脱色液pH值为5.5，脱色液浓度为10.0%，脱色前依诺肝素钠与树脂质量比为1∶1.5，脱色液流速为2.0 BV· h-1。在此条件下，脱色率大于98.5%，脱色收率大于98.0%，脱色后依诺肝素钠溶液颜色浅于欧洲药典黄色6号，脱色后溶液颜色、效价均符合欧洲药典，脱色前后依诺肝素钠分子量无显著变化。

依诺肝素钠；树脂；脱色

依诺肝素钠系通过对猪肠粘膜来源的肝素苄酯衍生物解聚而获得，由一系列未被完全定性的复杂寡糖组成。其制备过程主要包括成盐、酯化、解聚[1]，解聚是在碱性加热条件下进行的，肝素苄酯发生水解反应和β-消除反应致肝素糖链断裂，在还原端会发生葡萄糖胺与甘露糖胺的差向异构化，末端葡萄糖胺有6-O-硫酸基化取代的会脱硫酸基，形成1,6-脱水结构[2]。在解聚过程中疑似发生了美拉德反应，导致有色物质产生。由于有色物质带有多糖的母核，与依诺肝素钠性质相似，溶于水，并可以与依诺肝素钠一同醇沉，给脱色处理带来一定困难[3]。作者通过筛选脱色树脂型号及脱色条件，确定了最优的依诺肝素钠树脂脱色工艺。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

肝素钠，自制；DOWEX OPTIPORE SD-2树脂，陶氏化学；D-293树脂，上海华震科技有限公司；LSA-700B树脂，西安蓝晓科技公司。

苄索氯铵，江苏和创化学有限公司；二氯甲烷、氯化苄、甲醇、无水乙酸钠、氢氧化钠、氯化钠、盐酸，均为分析纯，市售；纯化水，自制。

TU-1900型紫外可见分光光度计，普析通用公司；S25-2型恒温磁力搅拌器，上海司乐仪器有限公司。

1.2 脱色前依诺肝素钠的制备

取100 g肝素钠用1 000 mL水溶解，再取250 g苄索氯铵用1 250 mL水溶解；将苄索氯铵溶液缓慢加至肝素钠溶液中，离心，水洗，真空干燥，得到肝素季铵盐；用肝素季铵盐质量5倍体积(体积/质量，mL∶g，下同)的二氯甲烷溶解，再加入肝素季铵盐质量1倍体积的氯化苄，于35 ℃下反应25 h，加入肝素季铵盐质量6倍体积的10%乙酸钠甲醇溶液，过滤，甲醇洗涤，干燥，得肝素苄酯；加入肝素苄酯质量25倍体积的水溶解，再加入肝素苄酯质量9%的氢氧化钠，62 ℃下反应1.5 h，冷却至20 ℃左右，同时用盐酸中和，加入水3倍体积的甲醇醇沉，过滤，干燥，得脱色前依诺肝素钠。

1.3 树脂脱色实验

脱色前依诺肝素钠用水溶解，水溶液偏黄，用紫外可见分光光度计进行可见光全波长扫描，发现在400 nm附近溶液有明显吸收，可通过监测溶液在400 nm下的吸光度判断脱色效果。

准确称取脱色前依诺肝素钠5 g，加水溶解成一定浓度，调节溶液pH值，测定400 nm下的吸光度；加入脱色树脂，搅拌脱色一定时间，滤除树脂；溶液中加入溶液体积1%(质量/体积，g∶mL)的氯化钠，再加入溶液体积4倍的甲醇醇沉，静置；滤除上清液，干燥，得脱色后依诺肝素钠，称重；加水溶解至初始脱色液体积，测定400 nm下的吸光度，按下式计算脱色率和脱色收率。

2 结果与讨论

2.1 脱色树脂型号的筛选

取9份脱色前依诺肝素钠用水溶解成浓度约10.0%的溶液，编号1#～9#，其中1#、2#、3#溶液调节pH值至5.0，4#、5#、6#溶液调节pH值至7.0，7#、8#、9#溶液调节pH值至9.0，然后在1#、4#、7#溶液中加入SD-2树脂，2#、5#、8#溶液中加入D-293树脂，3#、6#、9#溶液中加入LSA-700B树脂，树脂均与脱色前依诺肝素钠等重，缓慢搅拌5 h，按1.3方法进行后续处理，结果见表1。

表1 不同型号树脂在不同酸碱度下的脱色效果/%

Tab.1 The decolorization effect of different types of resin at different pH values/%

从表1可以看出，3种脱色树脂脱色收率均大于96%，说明3种脱色树脂对依诺肝素钠的吸附作用很小；在溶液偏酸性条件下树脂对依诺肝素钠的脱色效果最好，其中SD-2树脂脱色效果最好。因此，选择SD-2树脂在偏酸性条件下对依诺肝素钠进行脱色实验。

2.2 脱色液pH值的选择

取5份脱色前依诺肝素钠用水溶解成浓度约10.0%的溶液，分别调节溶液pH值至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，加入与脱色前依诺肝素钠等重SD-2树脂，缓慢搅拌5 h，按1.3方法进行后续处理，结果见表2。

表2 不同pH值下的脱色效果

Tab.2 The decolorization effect at different pH values

从表2可以看出，依诺肝素钠在pH值5.5时的脱色效果最佳。

2.3 脱色液浓度的选择

取5份脱色前依诺肝素钠分别用水溶解成浓度约6.0%、8.0%、10.0%、12.0%、14.0%的溶液，调节溶液pH值至5.5，加入与脱色前依诺肝素钠等重SD-2树脂，缓慢搅拌5 h，按1.3方法进行后续处理，结果见表3。

表3 不同脱色液浓度下的脱色效果/%

Tab.3 The decolorization effect at different concentrations of decolorization solution/%

从表3可以看出，溶液浓度为8.0%～10.0%时，脱色率较高。为了降低醇沉溶剂用量，选择较高脱色液浓度，即选择脱色液浓度为10.0%。

2.4 脱色前依诺肝素钠与树脂质量比的选择

取5份脱色前依诺肝素钠用水溶解成浓度约10.0%的溶液，调节溶液pH值至5.5，分别按照脱色前依诺肝素钠与树脂质量比(g∶g)为1∶1.0、1∶1.5、1∶2.0、1∶2.5、1∶3.0加入SD-2树脂，缓慢搅拌5 h，按1.3方法进行后续处理，结果见表4。

表4 不同脱色前依诺肝素钠与树脂质量比下的脱色效果

Tab.4 The decolorization effect at different mass ratios of enoxaparin sodium before decolorization and resin

从表4可以看出，脱色前依诺肝素钠与树脂质量比为1∶(1.0～2.0)时，脱色率较高。为了确保脱色效果，选择使用略过量的脱色树脂，故选择脱色前依诺肝素钠与树脂质量比为1∶1.5。

2.5 脱色液流速的选择

取5份脱色前依诺肝素钠用水溶解成浓度约10.0%的溶液，调节溶液pH值至5.5,分别注入装有SD-2树脂的树脂柱，脱色前依诺肝素钠与树脂质量比为1∶1.5，分别控制流速 (BV·h-1，树脂床体积·h-1)为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0,按1.3方法进行后续处理，结果见表5。

表5 不同脱色液流速下的脱色效果

Tab.5 The decolorization effect at different flow rates of decolorization solution

从表5可以看出，流速为1.0～2.0 BV·h-1时脱色率较高。为了节省脱色时间，选择脱色液流速为2.0 BV·h-1。

2.6 动态脱色验证实验结果

取3份脱色前依诺肝素钠测定分子量后用水溶解成浓度约10.0%的溶液，调节溶液pH值至5.5，分别注入装有SD-2树脂的树脂柱，脱色前依诺肝素钠与树脂的质量比为1∶1.5，脱色液流速为2.0 BV·h-1，脱色液用甲醇醇沉，静置；滤除上清液，干燥，称重，用水溶解至初始脱色液体积，测定溶液在400 nm下的吸光度，计算脱色率、脱色收率，并测定脱色后依诺肝素钠的分子量、溶液颜色及效价，结果见表6。

表6 树脂脱色验证实验结果

Tab.6 The verification results of decolorization with resin

编号123脱色率/%98.6198.5998.66脱色收率/%98.1398.0998.15Mw/Da 脱色前脱色后448044914452446544754482溶液颜色浅于黄色6号浅于黄色6号浅于黄色6号AXaIU/(IU·mg-1)105104103AⅡaIU/(IU·mg-1)28.027.927.5

从表6可以看出，按照选定的脱色条件进行脱色，脱色率大于98.5%，脱色收率大于98.0%，脱色后依诺肝素钠溶液颜色、效价均符合欧洲药典规定[4]，脱色前后分子量无显著变化。

3 结论

采用DOWEX OPTIPORE SD-2树脂对依诺肝素钠进行脱色，确定最优的脱色条件为：脱色前依诺肝素钠与树脂质量比1∶1.5，脱色液浓度10.0%、脱色液pH值5.5，脱色液流速2.0 BV·h-1。在此条件下，脱色率大于98.5%，脱色收率大于98.0%，脱色后依诺肝素钠溶液颜色浅于欧洲药典黄色6号，脱色后溶液颜色、效价均符合欧洲药典规定，脱色前后依诺肝素钠分子量无显著变化。

[1] DEBRIE R.Mixtures of particular LMW heparinic polysaccharides for the prophylaxis/treatment of acute thrombotic events:US 5389618[P].1995-02-14.

[2] 张利赟.两种低分子肝素(LWMH)生产工艺及质量标准研究[D].济南：山东大学，2010.

[3] 金飞，徐飞虎，王彦广.依诺肝素钠的制备与纯化[J].中国医药工业杂志，2008，39(1)：15-17.

[4] 欧洲药典委员会.欧洲药典[S].9.0版.欧洲药品质理管理局，2017：2352-2354.

Decolorization Process of Enoxaparin Sodium with Resin

LI Ning1,ZHANG Jing-yan1,REN Feng-zhi1,ZHANG Xue-xia1,LIU Jian-fen2*

(1.NewDrugR&DCo.,Ltd.ofNCPC,NationalEngineeringResearchCenterofMicrobialMedicine,HebeiIndustryMicrobialMetabolicEngineering&TechnologyResearchCenter,Shijiazhuang050015,China; 2.HuaKunHebeiBiologicalTechnologyCo.,Ltd.ofNCPC,Shijiazhuang050000,China)

We studied the decolorization process of enoxaparin sodium with decolorizing resin.Using decolorization rate and yield of enoxaparin sodium as indexes,we investigated the effects of resin type,pH value and concentration of decolorization solution,the mass ratio of enoxaparin sodium before decolorization and resin,and the flow rate of decolorization solution on decolorization effect.The optimal decolorization conditions were as follows:DOWEX OPTIPORE SD-2 as decoloring resin,pH value of decolorization solution was 5.5,concentration of decolorization solution was 10.0%,the mass ratio of enoxaparin sodium before decolorization and resin was 1∶1.5,and flow rate was 2.0 BV·h-1.Under above conditions,decolorization rate was more than 98.5%,decolorization yield was more than 98.0%, enoxaparin sodium solution after decolorization had lighter color than yellow 6#of European Pharmacopeia (EP),the titers accorded with EP standard,and the molecular weight of enoxaparin sodium did not obviously change before and after decolorization.

enoxaparin sodium；resin；decolorization

2017-03-28

李宁(1979-)，男，河北石家庄人，高级工程师，主要从事药物分离纯化及质量研究，E-mail：aln365@163.com；通讯作者：刘建芬，执业药师，E-mail：119797212@qq.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.07.010

R973.2

A

1672-5425(2017)07-0047-03

李宁，张静岩，任风芝，等.依诺肝素钠树脂脱色工艺研究[J].化学与生物工程，2017，34(7)：47-49.