液氮保种对田鼠巴贝虫标准株存活力的影响

蔡玉春，陈家旭，卢 艳，艾 琳，吴 芬，陈韶红



液氮保种对田鼠巴贝虫标准株存活力的影响

蔡玉春1，2，陈家旭1，卢 艳1，艾 琳1，吴 芬1，陈韶红1

目的 探索液氮保种对田鼠巴贝虫标准株存活力的影响。方法 液氮保种1、3、6、9个月的田鼠巴贝虫标准株小鼠血室温复苏后感染正常BALB/c小鼠各3只(复苏1代，实验组)， 100 μL/只；同时取3只新感染田鼠巴贝虫活体保藏小鼠为对照组。实验组染虫率达高峰时再接种正常BALB/c小鼠(复苏2代)，观察田鼠巴贝虫的形态变化及增殖情况，并观察不同保存时间复苏1代及复苏2代的染虫率情况。结果 液氮保种田鼠巴贝虫与活体保种的田鼠巴贝虫相比，形态变化不大，都会出现小滋养体、环状滋养体、裂殖体及未成熟和成熟裂殖子等多种形态。液氮复苏1代首次查见虫体及达到染虫率高峰的时间比动物保种延迟1～2 d，但复苏2代即恢复一致。田鼠巴贝虫染虫全血经液氮保存1、3、6、9个月，仅达到高峰期时间延迟，其存活力未见明显下降。结论 液氮保种对田鼠巴贝虫形态及存活力影响小，可成为一种较好的保存方式。

田鼠巴贝虫；液氮保种；动物保种；存活力

巴贝虫在分类学上属于顶复门(phylum Apicomplexa)、孢子虫纲(Class Sporozose)、梨形虫亚纲(Subclass Prioplasmasina)、梨形虫目(Order Prioplasmida) 巴贝科(Family Babesidae)[1]。常见可感染人体的巴贝虫为田鼠巴贝虫(Babesiamicroti)、牛巴贝虫(B.bovis)、歧异巴贝虫(B.divegen)、马巴贝虫(B.equi)，其中以田鼠巴贝虫感染为多见[2],是一种重要的人兽共患血液原虫病。近年来，在美国[3]等国家被定为法定须呈报传染病，已经成为世界范围内影响人类健康的新威胁[4]。人体感染巴贝虫病是通过蜱的叮咬，其病原体巴贝(Babesidae.spp)虫体随唾液进入人体，侵染红细胞，引起红细胞破坏溶血,因此有蜱叮咬史且贫血是本病的典型症状。大多数病例症状是轻的，隐性的或自限性的，但对于年老或脾切除者等免疫力低下的人群或者患艾滋病等免疫缺陷患者可引起严重症状，甚至死亡[5]。据资料显示，截止2014年，我国有存活艾滋病感染者和病人448 226例，死亡138 956例[6]；作为发展中国家，我们的癌症发病率也居高不下[7]，而这些人群都是巴贝虫病感染的潜在人群，巴贝虫病在我国随时可能暴发；另外，巴贝虫病还可通过输血传播，由于我国对血源尚无检测巴贝虫的要求，这在输血时会造成很大的危害[8]。此前我国对巴贝虫病关注较少，巴贝虫病的致病机制还不明确，临床诊治及防控技术和策略等知识、技能和技术贮备都很匮乏，亟需开展此类疾病的科学研究工作，因此对已有巴贝虫株的长期持续保种显得尤为重要。常用的保种方法为动物模型传代法。目前已经建立有BALB/c小鼠、SCID小鼠和NOD-SCID小鼠3种动物模型[9]。但动物转种操作繁琐，成本较高，而且易发生遗传漂变、人为差错或混淆等问题[10]。随着冷冻技术及预防医学的发展[11]，寄生虫的低温保藏技术也蓬勃发展，低温保存技术不仅能克服传统保存方法的弊端，而且能延长寄生虫存活时间，保持其原有的生物学特性，疟原虫[10]、弓形虫[12]、利氏曼原虫[13]等寄生虫已经有较好的低温保藏技术。本研究拟在探索液氮保种对田鼠巴贝虫标准株存活力的影响，以建立田鼠巴贝虫的低温保藏方法，为田鼠巴贝虫的研究及巴贝虫病的药物筛选、免疫诊断和预防，也为建立“寄生虫保藏库”提供简便、实用的方法。

1 材料与方法

1.1 虫株与小鼠 田鼠巴贝虫(Babesiamicroti)，peabodymjr株购自美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)，货号: PRA-99。BALB/c小鼠购自中科院上海实验动物中心。

1.2 仪器与试剂 显微镜(日本奥林巴斯公司)，EDTA抗凝采血管(浙江拱东医疗科技有限公司)，0.9%生理盐水(上海长富制药公司)，地塞米松(山东新华制药公司)，吉姆萨染液原液(上海怡成生物科技公司)，甲醇(上海振兴化工一厂)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物转种 感染种鼠(红细胞染虫率，即虫密度为60%)眶窦取血，置EDTA抗凝采血管中，在无菌条件下以1∶3比例加0.9%生理盐水，使虫密度约为20%，腹腔接种10只正常BALB/c小鼠，100 μL/只。

1.3.2 虫株液氮保存 取8只感染田鼠巴贝虫虫密度为60%的种鼠全血在无菌条件下加等体积的二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)，将已封口的冻存管放入液氮罐的提筒，先置于液氮罐口14 cm处，该处预测为-70 ℃，30 min后，置于液氮中冻存。

1.3.3 虫株复苏 分别将液氮保存后1月、3月、6月、9月的含虫血各取出1只，放常温下静置，使其自然融化。取融化后血样与无菌0.9%生理盐水混合稀释为染虫率20%，经腹腔注射感染BALB/c小鼠各3只，100 μL/只；同时取动物保种种鼠血以相同的感染率新转种3只正常BALB/c小鼠，为动物保种对照组。动物接种当天记为第0 d(d0)，接种次日开始观察记为第1 d(d1)。自d1开始每天通过尾静脉采血，涂制薄血片、姬姆萨氏染液染色，油镜下观察田鼠巴贝虫的形态、增殖情况，记录红细胞的感染率。待BALB/c小鼠的感染率达到高峰期，再以相同剂量腹腔接种正常BALB/c小鼠，为复苏2代，观察田鼠巴贝虫的增殖情况及不同保存时间复苏1代及复苏2代的染虫率情况。

2 结 果

2.1 活体转种与液氮保存复苏巴贝虫形态比较 田鼠巴贝虫在活体转种的BALB/c小鼠中，在感染初期出现少量环状滋养体，第7 d达到染虫高峰，红细胞内出现大量虫体，红细胞裂解，虫体形态各异，小环状滋养体、大环状滋养体、长丝状裂殖体、未成熟及成熟裂殖子等，有些为两虫、三虫寄生，有严重的红细胞溶血现象。在感染后期，染虫红细胞明显大量减少，每视野中仅见2～4个环状体。经液氮保存1，3，6，9个月后，复苏传代，观察到不同保存时间的虫体形态未见明显改变，在感染初期，仍可见少量点状滋养体及小环状滋养体，感染高峰期仍可见较多大滋养体及长丝状、阿米巴状裂殖体、未成熟及成熟裂殖子，也可见溶血现象，在感染后期虫体大量被清除，仅可见少量点状及环状滋养体(见图1)。

2.2 活体转种与液氮保存复苏染虫率的变化比较 液氮保存1，3,6,9个月复苏转种1代染虫率高峰值在58%～61%之间，不同保存月份未见明显差异。复苏转种1代初次查见虫体的时间在第2～3 d，比活体转种延迟1～2 d，但复苏2代首次查见虫体的时间与活体转种首次查见虫体的时间一致。液氮保存复苏转种1代达到染虫高峰期时间是第9～10 d，比活体转种延迟2～3 d，但复苏2代达到染虫高峰期时间与活体转种达到染虫高峰期时间一致。在感染高峰时段，活体转种的染虫率最高，可达85%，其次是复苏2代，可达70%～73%，复苏一代均较低，为58%～61%之间。不同保存月份的复苏1代及2代在感染后期基本一致，都在第20 d染虫率降为0.5%(见表1)。

图1 液氮复苏对田鼠巴贝虫形态的影响Fig.1 Effect of liquid nitrogen freezing and redissolution to form change of B. microti

表1 活体保种和液氮复苏对田鼠巴贝虫染虫率变化的影响

Tab.1 Impact of infection rate ofB.microtiof BALB/c mice infection and liquid nitrogen freezing and redissolution

传代数(Generations)感染天数(Daysofinfection)感染初期(Earlystageofinfection)感染高峰(Infectionpeaks)感染后期(Latestageofinfection)活体转种对照组(Animalconservationcontrolgroup)d1(0．5%)d7(85%)d20(0．5%)复苏1代/液氮保存1个月(thefirstgenerationafterredissolution/1month)d2(0．5%)d9(65%)d20(0．5%)复苏2代/液氮保存1个月(thesecondgenerationafterredissolution/1month)d1(0．5%)d7(73%)d20(0．5%)复苏1代/液氮保存3个月(thefirstgenerationafterredissolution/3months)d3(0．5%)d9(61%)d20(0．5%)复苏2代/液氮保存3个月(thesecondgenerationafterredissolution/3months)d1(0．5%)d7(71%)d20(0．5%)复苏1代/液氮保存6个月(thefirstgenerationafterredissolution/6months)d3(0．5%)d9(58%)d20(0．5%)复苏2代/液氮保存6个月(thesecondgenerationafterredissolution/6months)d1(0．5%)d7(70%)d20(0．5%)复苏1代/液氮保存9个月(thefirstgenerationafterredissolution/9months)d3(0．5%)d10(58%)d20(0．5%)复苏2代/液氮保存9个月(thesecondgenerationafterredissolution/9months)d1(0．5%)d7(70%)d20(0．5%)

2.3 不同时间液氮保存复苏后染虫率的变化情况 田鼠巴贝虫染虫全血经液氮保存1个月，3个月，6个月，9个月，取出后接种BALB/c小鼠，为复苏1代，保存1个月、3个月，6个月，9个月后感染7 d染虫率分别为为23%、17%、20%和19%。复苏2代4个不同保存时间的7 d染虫率分别为73%、71%、70%和70%，见表2。

表2 不同时间液氮冷冻保存复苏对田鼠巴贝虫存活率影响评价

Tab.2 Evaluation of effect of liquid nitrogen freezing and redissolution to survival rate ofBabesiamicrotiin different time

保存时间(Storagetime)1个月(1month)3个月(3months)6个月(6months)9个月(9months)复苏1代(thefirstgenerationafterredissolution)23%17%20%19%复苏2代(thesecondgenerationafterredissolution)73%71%70%70%

接种时染虫率20%，感染后7 d数据 (the infection rate of intraperitoneal injection is 20%，the infection data is the data of seven days after infection)

3 讨 论

目前，田鼠巴贝虫保藏方法多为动物模型活体传代，但是，由于此虫种保藏周期短，需要大量的小鼠作为传代动物，浪费了大量人力和物力。而低温生物学自上世纪已广泛应用于医学研究的各个领域,在寄生虫领域的应用也十分广泛，特别是疟原虫、利氏曼原虫等原虫的液氮保存。在本研究中，我们对田鼠巴贝虫的活体保藏和液氮保藏进行了对比实验。首先比较了活体保种与液氮保种的田鼠巴贝虫形态及存活率的变化，比较发现，两种保存形式对田鼠巴贝虫的形态影响较小，液氮保存后再复苏转种，田鼠巴贝虫在小鼠体内还是经历点状滋养体、环状滋养体、长丝状或阿米巴状裂殖体、未成熟裂殖子及成熟裂殖子等形态变化，随着红细胞被胀大破裂后，裂殖子溢出，再侵入新的红细胞，重复出芽分裂繁殖。但液氮保存对田鼠巴贝虫的成活率有一定影响，活体保种在感染后第1 d即可发现少量虫体，而液氮复苏1代在感染后3 d才发现虫体。且复苏1代达到高峰期的时间会比活体保存的时间要延迟2～3 d，且高峰期的染虫率存在差异(活体保存为85%，液氮保存为58%左右)。但我们观察到，当复苏1代再经小鼠转种一代后，即恢复了与活体保存相同的存活力。本研究还观察了保藏时间对田鼠巴贝虫存活率情况的影响。观察发现，液氮保存不同月份对田鼠巴贝虫的存活率影响较小，本研究观察最长液氮保存时间为9个月，其复苏1代染虫率都会稍有降低，但复苏2代即可恢复原来的水平。但若进行BALB/c小鼠的动物活体保藏，一周需传代1次，9个月约需传代40余次，不但耗费了大量的人力物力，还有可能使田鼠巴贝虫的感染力下降。

近年来对巴贝虫病越来越重视，对巴贝虫病诊断、药物治疗及疾病控制等方面的研究越来越多，因此，有一种可长期低温保存虫株的方法，对巴贝虫病的研究有极大的支持作用。本研究通过实验证实田鼠巴贝虫的活体保藏和液氮保藏在形态及存活率上变化不大，这样可以大大节省人力、物力，有效保护了田鼠巴贝虫的感染力。但是由于国内保存田鼠巴贝虫标准株的工作开展不久，本研究也仅仅观察了液氮保存9个月时田鼠巴贝虫的虫体状态和存活力，有关田鼠巴贝虫低温保存的机理和关键影响因素如保护剂、冻融温度、冷冻速度等，目前还不清楚，还有待进一步摸索和改进，液氮保存田鼠巴贝虫的最长时间也需要进一步研究。

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Influence of liquid nitrogen cryopreservation to survive capability ofBabesiamicrotistandard strain

CAI Yu-chun1,2，CHEN Jia-xu1，LU Yan1，AI Lin1，WU Fen1，CHEN Shao-hong1

(1.NationalInstituteofParasiticDiseases,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention;LaboratoryofParasiteandVectorBiology,MinistryofPublicHealth;WHOCollaboratingCentreforTropicalDiseases,NationalCenterforInternationalResearchonTropicalDiseases,MinistryofScienceandTechnology,Shanghai200025,China；2.SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200433,China)

We discussed the influence of liquid nitrogen cryopreservation to survive capability ofBabesiamicrotistandard strain.The whole blood of mice infected withBabesiamicrotiwas put in liquid nitrogen to cryopreservation for 1 month，3 months，6 months，9 months，the whole blood was get out respectively and recovery at room temperature，and infected 3 mice respectively，100 μL/ mouse (the first generation after redissolution，the experiment group). In the same time，3 mice were also infected withBabesiamicrotias the animal conservation control group. When the infection rate was at a high level，the whole blood of the experiment group mice were injected into 3 normal BALB/c mice (the second generation after redissolution)，to observe the changes of theBabesiamicrotiform and proliferation situation，and also to observe the infection rate of the first and the second generation after redissolution in different conserving time. Compared withBabesiamicrotiof animal subcultivation，the form ofBabesiamicrotiof liquid nitrogen cryopreservation changed a little. Small trophozoites，annular trophozoites，schizont and immature and mature merozoite and other form can also be seen. Compared withBabesiamicrotiof animal subcultivation，the first time to see the worms and the time attaining to the high infection level were 1 to 2 days later，but for the second generation after redissolution，it is the same. There was no significant difference in different conserving time of 1,3,6,9 months. The influence of liquid nitrogen cryopreservation to survive capability and worm form ofBabesiamicrotiis a little，so liquid nitrogen cryopreservation can be a better way to conservingBabesiamicroti.

Babesiamicroti; liquid nitrogen cryopreservation; animal conservation; survive capability

Chen Shao-hong，Email: chensh637@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.07.002

国家科技基础条件平台专项寄生虫病和热带病科技资源中心项目和上海市卫计委青年基金项目(No.20154Y0155)联合资助(No.2016)

陈韶红，Email：chensh637@163.com

1.中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，世界卫生组织热带病合作中心，科技部国家级热带病国际联合中心，卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室，上海 200025；2.复旦大学生命科学学院，上海 200433

R382.3

A

1002-2694(2017)07-0583-05

2016-09-08 编辑：张智芳

Supported by the Tropical Diseases Resource Center Project of National Science and Technology Basic Conditions Platform Program (No.2016) and the Youth Fund of Shanghai Municipal Commission of Health and Family Planning (No. 20154Y0155)