不同产地知母中知母皂苷BⅡ和芒果苷的HPLC分析

钟鑫+霍蕾

摘 要： 目的：本文旨在通过测定不同产地知母药材中知母皂苷BⅡ和芒果苷的含量，改进知母含量测定方法，提高含量回收率，从而准确的评价不同产地知母药材的质量。方法：采用HPLC-ELSD和HPLC-DAD法测定了15个不同来源的知母样品，色谱条件：测定知母皂苷BⅡ的色谱柱为Ultimate XB C18（4.6×250mm，5μm），流动相为乙腈：水（25∶75），流速为1.0ml/min，柱温35℃，载气流速3.0L/min，漂移管温度110℃；测定芒果苷的色谱柱为Wondasil C18（4.6×200mm，5μm），流动相为乙腈：0.1%磷酸水溶液（16∶84），流速为1.0ml/min，检测波长为258nm，柱温35℃。结果：不同产地知母药材中知母皂苷BⅡ和芒果苷含量有明显差异。结论：山西产知母中知母皂苷BⅡ和芒果苷的含量均高于其他三省，河北易县产区亦较高。

关键词：知母 蒸发光散射 二极管阵列 知母皂苷 芒果苷

中图分类号：R282 文献标识码：A 文章编号：1003-9082（2017）07-0177-02

一、研究的意义

知母为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根茎，主产于河北、安徽、山西、内蒙古等地。知母始载于《神农本草经》，具有清热泻火、生津润燥、止渴除烦等功效，用于外感热病、高热烦渴、肺热燥咳、骨蒸潮热、内热消渴、肠燥便秘[1]等病证。知母的化学成分主要为甾体皂苷、双苯吡酮类、木脂素类、多糖类等，活性成分主要是甾体皂苷[2]，如知母皂苷BⅡ（timosaponinBⅡ）、芒果苷（mangiferin）等。现代研究表明，知母具有抗菌、解热、利胆、降血糖、降血脂等方面的药理作用[3]。知母虽为单一品种，但分布较广，各地产药材之间品质差异较大。本文采用了高效液相色谱-蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD法）及高效液相色谱–二极管阵列检测法（HPLC-DAD法）比较了多个不同产地知母中知母皂苷BⅡ和芒果苷的含量[4]，为更好地控制知母药材的质量提供了依据。

二、仪器与材料

Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；DAD检测器；Alltech 6000型蒸发光散射检测器、CBL-Model9960D型超声振荡仪、Sartorius BSA 224S型电子天平；甲醇和乙腈（色谱级，安徽时联特种溶剂股份有限公司），磷酸（分析級，维科特天津化工产品贸易有限公司），水为超纯水。其余试剂均为分析纯，芒果苷对照品（批号111607-201503，中国食品药品检定研究院）。知母皂苷BⅡ对照品（批号111839-201505，中国食品药品检定研究院）。知母药材采集于山西、河北、吉林、安徽等地。

三、研究方法与结果

1.知母皂苷BⅡHPLC-ELSD含量测定

1.1色谱条件：色谱柱：Ultimate XB C18（4.6×250mm，5μm）；流动相：乙腈-水（25：75）；柱温为35℃；ELSD漂移管温度：110℃，载气流速：3ml/min；对照品进样量为5μl、10μl，供试品进样量为8μl。

1.2对照品溶液的制备：取知母皂苷BⅡ对照品适量，精密称定，加30%丙酮制成每1ml 含0.50mg的溶液，即得。

1.3供试品溶液的制备：取知母药材粉末（过三号筛）约0.15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30%丙酮25ml，称定重量，超声处理（功率400W，频率40kHz）30min，取出，放冷，再称定重量，用30%丙酮补足减失的重量，摇匀。滤过，取续滤液，即得。

1.4线性关系考察：精密吸取对照品溶液1μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl分别进样，注入液相色谱仪中，测定色谱峰面积的标准曲线为：Y=1.551x-5.604，r=0.9993，在0.5～12.5μg范围内线性关系良好。

1.5 精密度试验：精密吸取上述对照品溶液各10μl，连续进样6次，测定知母皂苷BⅡ峰 面积，RSD为0.12%（n=6）。

1.6重现性试验取同一批次的知母饮片粉末6份，精密称定，按3.1.3项下方法制备供试品溶液，进样10μl，测定知母皂苷BⅡ含量平均为7.56%，RSD为1.01%。

1.7稳定性试验：取供试品溶液放置室温，每次进样10μl，分别在0、4、8、16、24、32h测定，峰面积的RSD为0.51%，表明样品在32h内稳定。

1.8加样回收率考察：取知母药材粉末0.15g，精密称定，加入知母皂苷BⅡ对照品适量，混合均匀后按照供试品溶液的制备及含量测定方法同法操作，测定知母皂苷BⅡ的含量，结果为知母皂苷BⅡ平均回收率为99.09%，RSD为1.68%。

1.9不同产地知母样品中知母皂苷BⅡ含量测定：按照上述条件、方法，别精密吸取对照品溶液5μl、10μl，供试品溶液8μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得样品中知母皂苷BⅡ的含量，含量结果见表1，色谱图见图1、图2。

2.芒果苷HPLC-DAD含量测定

2.1色谱条件：色谱柱：Wondasil C18（4.6×200mm，5μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（16：84）；流速为1.0mL/min；检测波长为258nm；柱温为35℃；进样量为10μl。

2.2对照品溶液的制备：取芒果苷对照品适量，精密称定，加稀乙醇制成每1ml含50μg的溶液，即得。

2.3供试品溶液的制备：取知母饮片粉末（过三号筛）约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25ml，称定重量，超声处理（功率400W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀。滤过，取续滤液，即得。

2.4线性关系考察：精密吸取对照品溶液适量置容量瓶中，用稀乙醇配制成含芒果苷浓度1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0μg·ml-1的对照品溶液，依次取上述溶液各10μl注入液相色谱仪中，以芒果苷的浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y）绘制标准曲线，并进行线性回归，结果芒果苷 的标准曲线为：Y=72897x-21322，r=0.9999，在1.0～40.0μg·ml-1范围内线性关系良好。

2.5精密度试验：精密吸取上述对照品溶液各10μl，连续进样6次，测定峰面积，RSD为0.94%（n=6）。

2.6重现性试验：取同一批次的知母饮片粉末6份，精密称定，按3.1.3项下方法分别制备供试品溶液，进样10μl，测定芒果苷含量平均为1.25%，RSD为1.51%。

2.7稳定性试验：取同一供试品溶液放置室温，分别在0、4、8、16、24、32h进样10μl测定样品含量，峰面积的RSD为1.67%，表明样品在32h内稳定。

2.8加样回收率考察：取一定量已知含量的样品6份，加入含芒果苷的高、中、低三个浓度的对照品溶液适量，混合均匀后按照供试品溶液的制备及含量测定方法同法操作，结果为芒果苷平均回收率为99.48%，RSD为1.44%。

2.9不同产地知母样品中芒果苷含量测定：按照上述条件、方法，测定样品中芒果苷的含量，含量结果见表1，色谱图见图3和图4。

四、讨论

本法首先采用二极管阵列检测器，对知母药材进行全波长扫描，建立知母药材全波长三维扫描图谱，确定了知母药材的最大吸收波长为（258nm）芒果苷，同时比较了多种比例的流动相包括乙腈-磷酸溶液、乙腈-甲酸溶液、乙腈-冰醋酸水溶液、甲醇-冰醋酸水溶液的分离效果，结果以乙腈-0.1%磷酸水溶液（16：84）的分离效果为优，分离度较好，保留时间适中，无干扰杂峰。并采用蒸发光检测器对知母中知母皂苷BⅡ进行了检测；通过以知母皂苷BⅡ和芒果苷含量为指标比较不同产地的知母药材质量。试验结果表明，不同产地的知母中知母皂苷BⅡ和芒果苷的含量有显著差别，以山西产地和河北易縣品质为最优。因此本法为知母药材的质量控制，为不同产地的知母药材的收购及栽培等提供了有效依据。

参考文献

[1]吉星，冯凡.知母中皂苷类成分研究进展[J].中草药，2010，41（4）：附12-附15.

[2]韩兵，李春梅，李敏等.知母皂苷的降脂及抗动脉粥样硬化作用[J].上海中医药杂志，2006，40（11）：68-70.

[3]罗洁，范旭航，崔思娇等.知母的UPLC、指纹图谱及聚类分析[J].中国现代应用药学，2013，30（1）：28-31.