亚洲棉EMS诱变条件优化与突变体筛选

孔德培，屈凌波，张雪妍，刘记，王鹏，李付广*

（1.河南工业大学／生物工程学院，郑州450001；2.中国农业科学院棉花研究所／棉花生物学国家重点实验室，河南安阳455000）

亚洲棉EMS诱变条件优化与突变体筛选

孔德培1,2，屈凌波1，张雪妍2，刘记2，王鹏2，李付广2*

（1.河南工业大学／生物工程学院，郑州450001；2.中国农业科学院棉花研究所／棉花生物学国家重点实验室，河南安阳455000）

【目的】明确适于亚洲棉诱变的甲基磺酸乙酯（EMS）最佳浓度和处理时间，创制优异亚洲棉突变体。【方法】用体积分数0.4%～1.5%EMS溶液浸泡处理亚洲棉石系亚1号种子4～8 h，分析不同时间、不同浓度的EMS溶液处理对石系亚1号种子萌发和生长的影响，并对M1、M2代突变株的形态学特征进行了初步鉴定。【结果】0.6%EMS溶液处理8 h，石系亚1号种子的发芽率、发芽指数分别为51%、18.84，诱变效果最佳。以该参数大规模诱变处理约23 000粒石系亚1号种子，共筛选获得M1代变异材料5559株，突变频率为48.37%；M2代变异材料825份，突变频率为14.17%，其中叶型、株型的突变频率最高，分别为8.0%，5.9%；M3代变异株系57个，变异性状遗传频率为31.30%，M3代新增突变频率为18.26%。【结论】本研究建立了亚洲棉种子EMS诱变体系，构建了亚洲棉石系亚1号M2突变群体，获得了36份可稳定遗传的突变体株系，为棉花功能基因组研究奠定了材料基础。

甲基磺酸乙酯；亚洲棉；突变体库；变异性状；石系亚1号

棉花是世界上最重要的经济作物之一，棉花产业在我国国民经济中占有重要地位。2015年，我国植棉面积287.3万hm2，约占世界总面积的12.9%；平均总产量 648万 t，占世界总产的24.8%，在世界棉花生产和国际贸易中占有重要地位[1]。但植棉机械化程度低，棉花品种抗病、抗逆性差，纤维品质差等因素一直制约着我国棉花生产发展。随着现代生物技术的迅速发展，利用分子育种、全基因组设计改良棉花农艺、经济性状，已成为解决上述问题的重要手段。随着雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）、亚洲棉（Gossypium arboreum）及陆地棉（Gossypium hirsutum）全基因组测序工作的完成，棉花遗传学研究进入功能基因组时代[2-4]。

突变体是功能基因组学研究的重要材料[5]。拟南芥（Arabidopsis thaliana）[6-7]、水稻（Oryza sativa）[8-9]等模式植物的功能基因组研究证明，突变体库的建立在基因组的研究、功能基因的挖掘方面具有重要作用。小麦（Triticum aestivum）[10]、玉米 （Zea mays）[11]、大豆 （Glycine max）[12]、烟草（Nicotiana tabacum）[13]、蕃茄 （Solanum lycopersicum）[14]等粮食经济作物突变体库的建立，加快了其基因功能的解析及遗传育种进程。

采用物理[15-16]、化学[5-14]、分子生物学[17-18]等诱变方法构建基因饱和突变体库，进而通过突变体分析鉴定基因功能，是研究基因功能最直接、最有效的方法。甲基磺酸乙酯 （Ethyl methanesulfonate，EMS）是植物诱变中最常用的高效化学诱变剂之一，它主要使鸟嘌呤烷基化，从而与胸腺嘧啶错配（C/G→A/T），诱发高密度的点突变，在株型（如矮化）、叶型（如叶片大小、叶色等）、花器（花瓣颜色、苞叶颜色、花器大小等）、育性及抗逆性等性状产生变异，生物学上广泛运用EMS诱变来创建突变体库和诱变育种[5-14]。McCallum等[5]将EMS诱变与高效液相检测技术结合形成了点突变高效自动化筛选方法TILLING技术。Abe等[8]利用EMS诱变构建了一个日本水稻品种的突变体库，通过对突变体与野生型杂交F2群体测序与SNP多态性分析绘制了其基因突变图谱，并定位挖掘了一个调控水稻叶色及株高性状的关键基因OsCAO1，为突变体筛选鉴定及遗传改良农作物性状开辟了新的途径。Parry等[19]利用EMS诱导创制了普通小麦的突变体库，筛选出106个突变体，并定位到淀粉品质相关的基因Wx-A1和株高相关基因GA20ox1A。Uchida等[20]利用全基因组测序对EMS诱变的拟南芥群体进行了分析。高速发展的新一代测序技术将广泛应用于突变体库的筛选与分析，这将为功能基因组学研究的飞速发展奠定基础。Eduardo等[21]对4个拟南芥anu缺失突变体进行全基因组重测序，挖掘到SECA2、TOC33、NAP14和CLPR1这4个调控叶片形状与叶色的关键基因。

虽然棉花遗传学研究进入功能基因组时代，但仍处于初级阶段，目前仅在陆地棉中见到突变体的诱导[22-23]，且主要用于诱变育种。亚洲棉是古老的二倍体（AA，2n=26）栽培棉种，在世界棉花基因库中占有极其重要的位置，具有早熟、适应性广、抗逆等优良特性，有很高的研究与应用价值，是功能基因组研究的经典遗传资源材料[24]，但目前国际上尚未见报道创建亚洲棉突变体库。因此，本研究以亚洲棉石系亚1号种子为材料，建立了亚洲棉EMS诱变体系，构建突变体库，并对突变体的形态性状进行了初步鉴定，为深入研究棉花功能基因组、挖掘抗逆性状调控相关功能基因等提供基础材料。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验用亚洲棉石系亚1号种子，为亚洲棉基因组测序用的高代（18代自交）自交纯合株系[3]，由国家棉花种质中期库杜雄明研究员提供。种子经浓硫酸脱绒，蒸馏水冲洗干净后晾干，精选后备用。试验于2015年5月—2016年11月在中国农业科学院棉花研究所试验地（河南安阳）、南繁基地（海南三亚）进行。

EMS购自Sigma公司（M0880-5G）。

1.2 实验方法

1.2.1EMS诱变参数优化。种子于28℃下磷酸缓冲液（100 mmol·L－1，pH 7.0）预浸12 h。随后用磷酸缓冲液配置体积分数分别为 0%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.5%的EMS溶液 （因素A1—A6），28℃黑暗条件下分别处理4 h、8 h（因素B1、B2），期间翻转轻摇。处理后用蒸馏水冲洗3次，每次30 min，以去除残留的EMS。每个浓度4次重复，每个重复处理100粒种子。种子直接种在砂床发芽盒中，置于恒温培养箱中（28℃，光照12 h/黑暗12 h）培养12 d，每天统计发芽种子数。

发芽率 = （发芽种子数／供试种子总数）× 100%；

发芽势=（第四天发芽种子数／供试种子总数）×100%；

发芽指数（GI）=ΣGt/Dt，式中，Gt为在t日的发芽数，Dt为发芽时间（d）。

1.2.2EMS规模诱变与M1代种植与观察。为构建亚洲棉突变体库，2015年8月共处理石系亚1号种子约23 000粒。种子用0.6%（V/V）的EMS溶液室温（28℃）黑暗条件下处理8 h后，播种于中棉所南繁基地试验田。试验采取间比法排列，每12行设置对照1行 （磷酸缓冲溶液处理的石系亚1号种子，即野生型）。田间栽培模式为：起垄覆膜、膜上打孔，膜宽0.9 m，一膜两行，膜间距0.7 m，株距0.2 m。人工点播（每穴2粒）后，拉喷带滴水1 h。常规田间管理，花蕾期进行自交。分别在子叶期、苗期、现蕾期、花期、铃期及吐絮期调查植株田间性状变异情况。吐絮后，按单株收获M1代种子。

成株率=成苗株数／处理种子数×100%；

突变频率=变异株数／成苗株数×100%.

1.2.3M2、M3代植株变异性状鉴定。2016年4月，从M1代种子中挑选形态变异和无形态变异共5920份按单株单行条播种植于中棉所试验田试验田，行长5 m、行距0.8 m，每15行设置1行对照。2016年10月从M2代株系中挑选形态变异材料共计115份，按株系进行单行点播种植于中棉所南繁基地试验田，行长5 m，覆膜喷灌，膜宽0.9 m、一膜两行、膜间距0.7 m、株距0.2 m，每21行设置1行对照。全生育期调查记录变异表型、变异株数量及比例，并对各突变表型进行拍照。花蕾期进行自交，分离的株系进行变异株单株收获、非变异单株株行混收。

1.3 田间农艺性状指标调查

调查时期及性状包括：（1）子叶期：子叶颜色；（2）苗期：叶色、叶形、株高、茎秆颜色；（3）蕾期：叶色、叶形、苞叶颜色、苞叶数、茎秆颜色；（4）花期：叶色、叶形、花瓣颜色；（5）铃期：叶色、叶形、苞叶颜色、铃型、棉铃颜色；（6）吐絮期：棉纤维颜色、棉纤维长度。

1.4 亚州棉EMS诱变后代变异性状可遗传概率计算

EMS诱变农艺性状可遗传突变率[25]=成株率×（M1代突变频率×M1代变异性状可遗传比例+M2代突变频率）×M2代变异性状可遗传比例。

1.5 数据分析

实验数据采用Microsoft Excel 2010进行均值和标准差的计算及制图，SAS 9.1软件进行方差分析(ANOVA)与多重比较数据分析。

2 结果与分析

2.1 亚洲棉EMS诱变参数的确定

对EMS诱变石系亚1号种子发芽试验中EMS浓度和处理时间进行二因素多水平试验设计，计算种子发芽势、发芽率与发芽指数。结果显示，EMS对石系亚1号棉花种子的萌发有抑制作用，随着EMS浓度的增大、处理时间的延长，对种子发芽势和活力的抑制作用越显著、甚至致死。石系亚1号种子EMS诱变的最佳参数为：0.6%EMS溶液，28℃下黑暗处理8 h，此时种子的发芽势为48%、发芽指数为18.84、发芽率为51%。

2.1.1EMS对种子萌发过程的影响。不同浓度的EMS处理后，种子活力降低，萌发延缓，抑制效应随剂量的增大而增大，各处理间差异显著 （P＜0.05）；随EMS处理时间的延长，发芽率显著降低（P＜0.05）。

发芽试验结果显示（表1）：当处理时间为B2时，种子萌发受抑制程度随着EMS剂量提高而逐渐增大；当EMS浓度提升至A6水平以上时，种子活力、发芽势及发芽率均接近为零，种子萌发抑制效应显著 （P＜0.05）。当EMS浓度为A3时，种子萌发受抑制程度随处理时间的延长而增大。其中处理时间水平由B1到B2时，发芽势为由83%降至48%，发芽指数由47.19降至18.84，发芽率由84%降至51%，差异显著（P＜0.05）。

2.1.2亚洲棉EMS最佳诱变参数。EMS浓度和处理时长均显著影响亚洲棉种子的萌发，二者间的交互作用对诱变处理的影响效应显著。结果表明，A4B1、A2B2和A3B2处理，可作为亚洲棉种子EMS处理的适宜条件。鉴于通常使用对材料造成半致死效应的参数作为诱变的最佳参数[16]，本试验选择了A3B2处理，作为EMS最佳诱变参数用于后续的亚洲棉种子EMS突变体库构建。

表1 EMS不同浓度和处理时间对亚洲棉种子萌发的影响Table 1 Effects of different concentrations of EMS and treat duration on seed germinationin Shixiya 1

2.2 亚洲棉种子EMS诱变M1代农艺性状鉴定

2015年8月，采用A3B2处理，对约23 000粒石系亚1号种子进行EMS处理，播种后获得11 493棵M1代单株，成株率49.97%。分别在子叶期、苗期、蕾期、花期、铃期及吐絮期，对诱变群体的农艺性状进行调查，筛选表型变异株。M1代植株表型丰富多样，但多表现为畸形生长（图1），M1代突变频率为48.37%，其中主要为株型变异，占成苗株数的41.66%；其次是叶型变异，突变株频率为6.24%（表2）。3354株M1代幼苗表现生长抑制，占成苗株数的29.18%，占株型变异株数的70.05%。两个及以上性状变异的株数为435，突变频率为3.78%。由于EMS的毒害作用，大部分突变植株未能开花结铃，最终收获突变单株359份。

2.3 亚洲棉种子EMS诱变M2代农艺性状鉴定

2016年4月，从M1代单株种子中挑选359个变异单株和5561个表型正常的单株的种子共计5920份，按株行种植于中棉所试验田，全生育期进行农艺性状鉴定。结果显示（表2）：M1代变异性状可遗传比例为10.31%，主要为株型中的成熟茎秆紫化（M2株型变异材料中15株（4.18%），同时表现出花瓣及苞叶颜色紫化现象）；M2代新出现变异株数为788；变异类型主要还是叶型，如叶色黄化（突变频率6.46%）、叶色白化（突变频率1.03%）、叶片皱缩（突变频率0.45%）等；其次是矮化、无茎尖等。

2.4 亚洲棉稳定遗传突变体的获得

为了筛选稳定遗传的突变体，从M2变异株系中挑选115份表型明显的材料，种于海南三亚，全生育期系统调查其后代M3代性状。结果显示，36份突变体表型与M2代表型一致。其中，叶色突变体24个，包括叶片黄斑化、叶片白化、叶片黄化3类（图2 B-D）；株型突变体2个，包括在亚洲棉中发现零式果枝突变体1个 （图2 F）；矮化突变体1个（图2 G）；叶形突变体2个，分别为叶片皱缩和叶片卷曲；其他类型突变体8个，包括黄色棉铃（图2 E）、紫色茎秆和苞叶（图 2 J）等。另外，这36个突变体收获后，于2017年4月种于安阳，M4代表型与M3代表型完全一致 （数据未发表），表明这些变异可稳定遗传，是本次诱变获得的新型突变体。

2.5 亚洲棉突变体变异性状的可遗传概率分析

根据EMS诱变成株率49.97%、M1代突变频率48.37%、M1代突变株变异性状可遗传比例10.31%、M2代突变频率14.17%及M2代突变株变异性状可遗传比例31.30%计算确定，在A3B2诱变处理条件下，亚洲棉石系亚1号种子后代发生可遗传突变率为3.00%。从理论上讲，每处理10 000粒种子，可获得300份稳定遗传的突变体材料，这为后续棉花功能基因组的研究提供了支撑。

图1 M1代典型突变体表型Fig.1 Representative mutant in M1plants

3 讨论

种质资源是作物育种和研究功能基因的重要基础。人工诱变可以创制出具有高产、优质、矮化、早熟、抗逆等优异农艺性状的新型种质资源，丰富育种与遗传研究的基础材料。在诸多的诱变技术体系中，EMS诱变技术是发展最成熟、应用最广泛的技术之一。

本研究以亚洲棉石系亚1号为试验材料，探索了EMS诱变剂对亚洲棉种子萌发及植株形态的影响。通过诱变参数优化、形态学鉴定及数据分析，初步建立了亚洲棉种子EMS诱变技术体系，并构建了亚洲棉石系亚1号EMS突变群体。0.6%EMS处理8 h，石系亚1号种子突变频率高达48.37%，可遗传突变率为3.00%，说明亚洲棉是较适合采用EMS诱变创制突变体库的作物。本研究初步获得了825份M2代突变体材料、36份可稳定遗传的M3代突变体材料，包含株型、叶型、花器、旱敏感等多种突变类型，是今后棉花功能基因组研究的宝贵材料。

表2 亚洲棉EMS诱变变异类型及频率Table 2 Phenotype and frequency of EMS mutants of Shixiya 1

薛守旺等[26]指出，高浓度的EMS溶液造成植物损伤和不育，处理后的种子在发芽时生长停滞或死亡。EMS诱变时，剂量和处理时间不同，诱变效果不同。剂量越大、处理时间越长，致死率越高，突变群体就会太少；剂量过低、处理时间过短，则变异不明显，筛选效率太低。因此，根据不同的试验条件，选择最优的诱变剂浓度和处理时间组合极为重要。此外，不同作物对EMS的敏感程度不同，EMS诱变的频率也差异极大。叶俊等[9]利用0.4%EMS处理水稻种子8 h，创建了水稻“9311”突变体库，突变频率为5.62%。徐艳花等[27]利用0.8%EMS诱变处理普通小麦豫农201种子12 h，突变频率达11.44%。Herring等[22]利用3%的EMS处理陆地棉种子2 h，筛选获得了纤维发育相关突变体材料。而穆国俊等[23]利用0.5%EMS处理陆地棉冀棉20种子4 h，筛选获得了纤维改良突变体材料。本研究在前人研究基础上，采用A3B2处理诱变亚洲棉种子，此时的发芽率、发芽指数分别为51%、18.84，可获得3.0%的稳定遗传突变体，是石系亚1号的最佳诱变参数。

与其他作物EMS诱变结果相似，石系亚1号M1代的形态变异中，株型和叶型突变频率最高，达41.66%和6.24%。大部分株型矮化变异是由于EMS毒性损伤引起，最后只收获到71份株型矮化和1份旺盛生长的M1变异材料。下一代种于安阳后，只有10份材料的矮化性状在M2代中可遗传但有分离，M2代中新增320份植株矮化突变体；旺盛生长的单株后代生长依旧旺盛。由于EMS引起的变异多为隐性突变，且M1代容易形成嵌合体，不能稳定遗传[7,14]，因此在 M2代筛选尤为重要。此外，亚洲棉属于二倍体，突变体在M2代即可纯合，大大缩短了获得稳定突变体的年限。经过3代筛选，本次诱变共获得稳定遗传突变体36份，其中叶色、叶型变异最多，占67%。目前，棉花零式果枝突变体仅在四倍体棉属中报道[28]，本次诱变得到的亚洲棉零式果枝突变体是首次在二倍体棉属中发现，进一步丰富了棉花种质资源库，是棉花果枝发育机理研究的重要材料。更为重要的是，EMS诱变机理明确[20]，结合二代测序技术容易明确突变位点[7-8,29]，对于进一步定位和克隆相关基因以及棉花功能基因组研究具有重要意义。

图2 部分EMS突变体表型Fig.2 New mutants from Shixiya 1 by EMS mutagenesis

受研究时间、工作量等因素限制，本研究仅分析鉴定了部分可见表型的突变体，下一步将针对产量（单株结铃性、铃重、籽指、衣分等）、品质（纤维品质、棉籽含油量、蛋白质含量等）、抗逆（盐碱、高温、耐渍等）及抗病（棉花黄萎病和枯萎病）等重要性状进行鉴定及变异率分析，进一步丰富棉花种植资源库。

4 结论

本研究通过参数优化建立了亚洲棉种子EMS诱变体系，构建了亚洲棉石系亚1号M2突变群体，筛选获得了36份可稳定遗传的突变体株系，不仅丰富了棉花种质资源，也为棉花功能基因组研究提供了宝贵材料。

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Optimization of EMS Mutagenesis Condition and Screening of Mutants inGossypium arboretumL.

Kong Depei1,2,Qu Lingbo1,Zhang Xueyan2,Liu Ji2,Wang Peng2,Li Fuguang2*
(1.Henan University of Technology,Zhengzhou450001,China;2.State Key Laboratory of Cotton Biology,Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Anyang,Henan455000,China)

[Objective]This research aimed to clarify the optimization of EMS concentration and treat duration on mutation ofGossypium arboretumL.and create excellent mutants library.[Method]Seeds ofGossypium arboreumline Shixiya1 were immersed in EMS solutions with volume fraction ranging from 0.4%to 1.5%by 4-8 h.Then,the seed germination index and seedling growth were analyzed and the morphological character of M1,M2,and M3generation were identified.[Result]The treatment with 0.6%EMS for 8 h was appropriate for Shixiya 1 mutagenesis.Under this treatment conditions,the seed germination index and the germination rate were 18.84 and 51%,respectively.To obtain abundant mutants,approximated 23 000 seeds of Shixiya 1were treated with 0.6%EMS for 8 h.5559 mutants were screened out from M1generation,825 and 57 from M2and M3, respectively.The mutation frequency of Shixiya 1 was 48.37%.The mutation frequency of leaf type variants,plant type variants were the highest in M2,which were 8.0%and 5.9%,respectively.The inheritable frequency of mutant characters from M2generation to M3generation was 31.30%,and the mutant frequency of M3generation was 18.26%.[Conclusion]This study have established the EMS mutagenesis system ofGossypium arboreumline Shixiya 1,and created 36 steadily inherited mutants.The mutant library we constructed will be a very useful genetic resource for functional genomics and genetic improvement in cotton.

ethyl methanesulfonate;Gossypium arboretumL.;mutant library;variation character;Shixiya 1

S562.035.2

A

1002-7807(2017)04-0336-09

10.11963/1002-7807.kdplfg.20170703

2017-03-29

孔德培（1987―），男，硕士研究生，助理研究员，kongdepei1987@163.com。*通信作者：aylifug@163.com

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（1610162016011）；国家自然科学基金联合基金（U1303282）