高效液相色谱-串联质谱法测定葡萄酒中11种磺酰脲类除草剂残留量

谢建军，吴俊辉，曾广丰，丁 博，王志元，卢 丽，陈文锐

(1.广东出入境检验检疫局技术中心，广东广州510623； 2.广东省动植物与食品进出口技术措施研究重点实验室，广东广州510623)

高效液相色谱-串联质谱法测定葡萄酒中11种磺酰脲类除草剂残留量

谢建军1，2，吴俊辉1，2，曾广丰1，2，丁 博1，2，王志元1，2，卢 丽1，2，陈文锐1，2

(1.广东出入境检验检疫局技术中心，广东广州510623； 2.广东省动植物与食品进出口技术措施研究重点实验室，广东广州510623)

建立了固相分散萃取结合高效液相色谱-串联质谱法(LC/MS-MS)快速测定葡萄酒中11种磺酰脲类除草剂残留量的方法。样品用乙腈快速提取、氯化钠和无水硫酸镁盐析后，经C18粉、中性Al2O3粉组合吸附剂净化，LC/MS-MS外标法定性定量。11种除草剂在10～100 μg/L范围内线性关系良好，相关系数R2在0.9921～0.9998范围内。空白样品添加标准品浓度在10～50 μg/kg时，其回收率在66.7%～86.1%之间，相对标准偏差(n=6)小于8.5%，方法的检出限(LOD)介于1.5～6.8 μg/kg之间。本方法简单、准确、快速，适用于葡萄酒中11种磺酰脲类除草剂残留量的检测。

QuEChERS； 葡萄酒； 高效液相色谱-串联质谱； 除草剂

目前，我国葡萄酒消费量已达到每年12亿升，巨大的市场需求带动葡萄酒进口量不断攀升。与此同时，葡萄酒的质量安全和品质也越来越受到人们的重视[1]。葡萄在种植生长过程中因易受到病虫、草害的侵扰而被施用杀菌剂、杀虫剂和除草剂等多种农药。在酿制葡萄酒的过程中，部分残留农药会进入葡萄酒中，造成农药残留[2]。农药残留对葡萄酒的发酵具有一定影响，并给葡萄酒的感官质量带来不良影响，同时，葡萄酒中残留的农药也会对消费者带来食品安全隐患[3]。目前，检测葡萄酒农药残留的方法主要有气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱联用法[4-6]、液相色谱-质谱联用法等[7-9]，但葡萄酒中磺酰脲类除草剂残留量的检测方法鲜有报道。

我国在葡萄酒及酿酒葡萄农药残留标准方面与发达国家相比还有不小的差距。欧盟制定了酿酒葡萄的最大农药残留限量（MRLs），但并未专门制定葡萄酒中农药MRLs[10]，意大利、瑞士、加拿大、澳大利亚制定了葡萄酒中部分杀菌剂和杀虫剂MRLs[11-12]。我国由于葡萄酒法规不完善，目前并没有单独制定葡萄酒中农药的MRLs，还是参照GB 2763—2016《食品中农药最大残留限量》中葡萄的农药残留限量指标[13]。

本研究在QuEChERS前处理的基础上，通过对5种净化吸附剂筛选，确定C18粉30.0 mg和Al2O3粉30.0 mg吸附剂组合，优化了LC/MS-MS质谱参数和液相条件，确定液相色谱柱，建立了同时检测葡萄酒中11种磺酰脲类除草剂残留量的快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 样品、试剂及仪器

葡萄酒样品：由广东出入境检验检疫局辖区口岸提供。

试剂及耗材：乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)；无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠、柠檬酸氢二钠、甲酸(色谱纯，CNW Technologies公司)；实验用水为经Milli-Q净化系统过滤的超纯水（电阻率为18.2 MΩ）；Atlantis®T3色谱柱(3.0 mm×100 mm，3µm，美国Waters公司)；Poroshell 120 EC-C18色谱柱(2.1 mm×150 mm，2.7 µm，美国Agilent公司)；PSA(乙二胺-N-丙基硅烷，粒度 40～63 μm，CNW Technologies公司)；石墨化碳黑(GCB，粒度120～400目)、中性氧化铝粉(Al2O3，粒度100～200目)、氨丙基粉(NH2，粒度 200～400 目)，C18粉(C18，粒度100～200目，北京振翔工贸有限公司)；苄嘧磺隆,甲黄隆、氟磺隆等11种除草剂混标购自德国Dr．Ehrenstorfer公司，50 μg/mL。

仪器设备：API4000Q Trap超高压液相色谱-三重四极杆串联质谱仪(美国AB公司)；IKA Ms 3 basic涡旋振荡器(德国IKA公司)；Heidolph promax 2020水平振荡仪(德国Heidolph公司)；Sigma 3-18 K，1-14离心机(美国Sigma公司)；Milli-Q超纯水装置(美国Millipore公司)；0.22 μm微孔滤膜(美国Whatman公司)。

1.2 标准工作溶液的配制

准确量取50 μg/mL 11种除草剂农药标准品混合标准溶液,置于10 mL容量瓶中,用乙腈溶解并定容,配制成10 μg/mL的标准储备液，-18℃冰箱中保存。使用前根据需要将标准储备液用空白基质提取液稀释成适当浓度的标准工作液,现配现用。

1.3 样品预处理

1.3.1 提取

称取10 g（精确至0.01 g）葡萄酒于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈提取溶剂，涡旋振荡1 min后加入1 g氯化钠、4 g无水硫酸镁、0.5 g柠檬酸钠、0.5 g柠檬酸氢二钠，混匀后置于水平振荡器中振荡10 min，4500 r/min离心5 min，待净化。

1.3.2 净化

取1.3.1中上清液1 mL于1.5 mL离心管中，加入30 mg C18、30 mg Al2O3粉，涡旋1 min，12000 r/min高速离心10 min，0.22 μm微孔滤膜过滤，LC/MSMS上机测定。

1.4 色谱与质谱条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：Poroshell 120 EC-C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，2.7µm）；流速：0.3 mL/min；进样体积：10 μL；柱温：35℃；流动相：A-甲醇；B-0.1%甲酸-5mmol/L甲酸铵；梯度洗脱条件见表1。

1.4.2 质谱条件

离子源：电喷雾式离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描，MRM模式，质谱参数：气帘气（CUR）N2，20 psi；电离电压（IS），5500 V；离子源温度（TEM），550 ℃；雾化气（GAS1）N2，50 psi；加热辅助气（GAS2）N2，50 psi；碰撞气（CAD）N2，MEDIUM；监测方式MRM。

表1 ESI模式下液相色谱洗脱条件

2 结果与讨论

2.1 色谱条件与质谱条件优化

本实验以11种除草剂的混合标准溶液（100ng/mL）进样，分别比较了乙腈-0.1%甲酸-5 mmol/L甲酸铵溶液、甲醇-0.1%（V/V）甲酸-5 mmol/L甲酸铵溶液，甲醇-0.2%（V/V）乙酸水溶液、甲醇-0.1%（V/V）甲酸水溶液、甲醇-5 mmol/L甲酸铵溶液等5种流动相对于各种除草剂的色谱分离及质谱响应的影响。实验发现，使用乙腈作为有机相，个别除草剂没有质谱响应，使用甲醇作为有机相，11种除草剂均有良好的质谱响应，因此选择甲醇作为有机相，0.1%甲酸-5 mmol/L甲酸铵溶液作为水相，可使11种除草剂有良好的色谱分离及质谱响应。

磺酰脲类化合物由芳环、磺酰脲桥和杂环三部分组成，在正离子电喷雾电离模式下，易形成较高丰度的[M+H]+准分子离子。三氟啶磺隆钠、甲基碘磺隆钠为钠盐，在正离子模式下形成[M-Na+H]+准分子离子。磺酰脲类除草剂的质谱断裂主要发生在磺酰脲桥上，易产生m/z 141、m/z 167、m/z 156、m/z 182等碎片离子，以醚苯磺隆1为例，磺酰脲类除草剂碎裂方式见图1，11种除草剂的质谱参数见表2。

2.2 吸附剂的选择优化

2.2.1 吸附剂种类和用量的筛选

图1 醚苯磺隆的二级质谱图主要质谱裂解产物

本实验采用回收试验法，筛选合适的吸附剂的组成和比例，以期获得满足农药残留量分析的净化效果。分别称取30 mg、50 mg、100 mg、150 mg的PSA粉、GCB粉、NH2粉、Al2O3粉和C18粉于1.5 mL离心管中，加入50 μg/L的11种除草剂混合标准溶液，涡旋1 min，静置10 min，12000 r/min离心10 min，取上清液过0.22 μm滤膜，经LC/MS-MS分析。结果表明，PSA粉、NH2粉和GCB粉对磺酰脲类除草剂吸附较明显，回收率介于0%～47.4%之间，与文献[14]报道的0%～38%接近，NH2粉同样有较明显的吸附，回收率＜40%；C18粉和Al2O3粉对于11种除草剂的吸附作用不明显，回收率在60%以上,所以本实验考虑选用C18粉和Al2O3粉作为净化吸附剂的种类。

2.2.2 吸附剂最佳组合的确定

通过2.2.1的初步实验，确定了吸附剂的种类和大致用量范围，为进一步优化吸附剂的用量，设计实验考察4组C18粉、Al2O3粉的组合回收实验。将C18粉20 mg、30 mg与Al2O3粉20 mg、30 mg进行组合，具体操作按照2.2.1进行。实验结果表明，C18粉30 mg、Al2O3粉30 mg组合的回收率良好，可满足农药残留检测的要求。因此确定30 mg C18粉、30 mg Al2O3粉的组合作为吸附剂，后续的实验也表明上述组合完全可以满足葡萄酒中这11种除草剂残留检测的要求。

2.3 提取溶剂的选择

通过对空白葡萄酒样品进行加标回收实验，本实验比较了乙腈、1%醋酸乙腈对葡萄酒中11种除草剂的提取效率。实验结果表明，乙腈和1%醋酸乙腈作为提取溶剂均能获得较满意的回收率，但是大部分除草剂用纯乙腈作提取溶剂的回收率高于1%醋酸乙腈的回收率。因此，本实验选择乙腈作为葡萄酒中11种除草剂残留量检测的提取溶剂，两种提取溶剂回收率结果见图2。

图2 不同提取溶剂对空白葡萄酒添加11种除草剂回收率的影响

2.4 线性范围与检测限

采用空白葡萄酒样品，按“1.3样品预处理”净化后的基质溶液配制浓度分别为10µg/L、20µg/L、40µg/L、60µg/L、80µg/L、100µg/L的标准溶液，按“1.4色谱与质谱条件”测定，以峰面积Y为纵坐标，质量浓度X(µg/L)为横坐标，绘制标准工作曲线，得到其相关线性方程。结果表明，11种农药在10～100 μg/L范围内线性关系良好，相关系数R2在0.9921～0.9998之间,根据信噪比S/N≥3确定方法的检测限(LOD)在1.5～6.8 μg/kg之间，11种除草剂的保留时间、质谱参数、检出限、线性方程和相关系数见表2和表3。

2.5 基质效应的去除

由于葡萄酒样品基质复杂，比较纯乙腈和空白葡萄酒基质提取液配制标准作标准曲线进行定量时，发现纯乙腈配制的标准曲线在定量情况下除草剂的响应受到不同程度的基质效应影响。基质效应(ME)计算公式为：ME(%)=(A1-A2)/A2×100%，其中A1、A2分别为基质与空白溶液中除草剂的响应值。由计算结果可知，胺苯磺隆表现为明显的基质抑制效应，ME(%)为-84.18%，甲磺胺磺隆基质效应ME(%)分别为9.9%，表现为弱基质效应，另外9种除草剂则表现为较强的基质增强效应，ME(%)在14.4%～111.3%之间，结果见表3。因此，本方法使用空白葡萄酒样品净化后基体配制标准，制作基质标准曲线进行定量以消除基质效应的干扰。

表2 11种除草剂的质谱参数、线性方程和相关系数

表3 空白葡萄酒样品中添加11种除草剂标准的测定保留时间、检测限、平均回收率及相对标准偏差(n=6)

2.6 方法的精密度、准确度

按“1.3样品预处理”步骤，测定方法的回收率和精密度。在葡萄酒空白样品中分别添加10µg/kg、20µg/kg、50µg/kg 3个水平的11种除草剂标准，每个添加水平平行实验6次，计算11种除草剂的平均回收率和相对标准偏差RSD值（%）。结果表明，11种除草剂的平均回收率处于66.7%～86.1%之间，相对标准偏差(n=6)＜8.5%，结果见表3。空白葡萄酒基体配制11种除草剂标准品的多反应监测（MRM）色谱图见图3。

2.7 实际样品测定

采用本研究建立的QuEChERS前处理方法结合LC-MS/MS分析方法对法国、西班牙、澳大利亚、意大利等不同国家的40个葡萄酒样品进行检测，结果发现11种除草剂均没有检出。

3 结论

图3 11种除草剂的多反应检测色谱图

本实验主要应用QuEChERS法对葡萄酒中11种除草剂残留进行前处理，研究优化了提取溶剂和净化用吸附剂种类及用量，优化了LC/MS-MS质谱参数和液相条件，建立了固相分散萃取净化，LC/MS-MS同时检测葡萄酒中11种除草剂残留量快速检测方法。样品经乙腈振荡提取，C18粉30.0 mg和Al2O3粉30.0 mg，吸附杂质净化后，用LC/MSMS外标法定性定量。结果表明，当添加水平为10～50 μg/kg时，11种除草剂的回收率介于66.7%～86.1%之间，相对标准偏差(n=6)小于8.5%，方法的检出限(LOD)介于1.5～6.8 μg/kg之间。本方法可同时一次性检测11种除草剂，前处理简单，操作简便，方法的重现性好，灵敏度高，可用于我国进口葡萄酒质量监管及国内市场葡萄酒质量监测。

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Determination of 11 Kinds of Sulfonylurea Herbicide Residues in Grape Wine by QuEChERS Combined with LC/MS-MS

XIE Jianjun1,2,WU Junhui1,2,ZENG Guangfeng1,2,DING Bo1,2,WANG Zhiyuan1,2,LU Li1,2and CHEN Wenrui1,2
(1.Technical Center of Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Guangzhou,Guangdong 510623;2.Guangdong Technical Measures Research Key Lab of Import and Export Animal,Plant and Food,Guangzhou,Guangdong 510623,China)

The method for rapid determination 11 kinds of sulfonylurea herbicide residues in grape wine by solid-phase dispersion combined with LC/MS-MS had been developed in this study.11 kinds of herbicide residues were extracted from wine samples with acetonitrile,salted out with sodium chloride and anhydrous magnesium sulfate,and cleaned up with C18and Al2O3powder.These residues were detected by LC/MS-MS with external standard method.The results showed that,there was a good linear relationship in range of 10～100 μg/L,the correlation coefficients were in the range of 0.9921～0.9998,the recoveries were in the range of 66.7%to 86.1%at the spiked levels of 10～50 μg/kg in grape wine,RSDs was less than 8.5%(n=6),and the limit of detection were 0.2～10 μg/kg.This newly-developed method had the advantages including simple operation and accurate and rapid determination,and it could be used for the determination of 11 kinds of sulfonylurea herbicide residues in grape wine.

QuEChERS;grape wine;LC/MS-MS;herbicides

TS262.6；TS261.7；O657.63；S482.4

A

1001-9286（2017）07-0115-06

10.13746/j.njkj.2017052

广东出入境检验检疫局科技计划项目（2014GDK13）。

2017-03-08

谢建军（1972-），男，高级工程师，博士，主要研究方向为食品安全检测技术。

优先数字出版时间：2017-05-25；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170525.1314.005.html。