胶体金免疫层析法对重金属汞残留的快速检测

王 森，叶国华，陈笑笑，胡叶军*，周丽燕

(1.绍兴市农产品质量监督检验测试中心，浙江 绍兴 312000； 2.杭州南开日新生物技术有限公司，浙江 杭州 310051)

胶体金免疫层析法对重金属汞残留的快速检测

王 森1，叶国华1，陈笑笑2，胡叶军2*，周丽燕1

(1.绍兴市农产品质量监督检验测试中心，浙江 绍兴 312000； 2.杭州南开日新生物技术有限公司，浙江 杭州 310051)

采用免疫竞争法，将抗重金属汞单克隆抗体—胶体金复合物包被在胶体金结合垫上，将人工合成的重金属汞抗原包被在硝酸纤维素薄膜表面作为检测线(T线)，其与待测样品中重金属汞竞争结合胶体金标记的重金属汞单克隆抗体，并通过T线和C线上肉眼可见的颜色显示检测结果。检测水质时，灵敏度最低值可达1 μg·L-1，整个检测过程只需3～5 min。胶体金免疫层析法具有较高的灵敏度及特异性，操作便捷，可用于快速检测重金属汞残留。

重金属汞； 半抗原； 免疫测定； 胶体金

重金属污染是水污染的主要问题之一，矿山开采、金属冶炼、化工生产废水、施用农药化肥和生活垃圾等人为污染，以及地质侵蚀、风化等天然因素均能导致重金属以各种形式进入水体。汞是最为常见的重金属之一，汞中毒以慢性为多见，主要症状为精神-神经异常、齿龈炎、震颤，有时还会产生幻觉，急性中毒有腹痛、腹泻、血尿等症状，20世纪50年代在日本发生的水俣病就是由于汞污染引起。我国《地表水环境质量标准》(GB 3838—2002)Ⅴ类地表水水质中汞的限量标准为1 μg·L-1，《生活饮用水卫生标准》(GB 5749—2006)中汞、铅、镉、铜的限量标准分别为1 μg·L-1。

目前，国内外检测水质中重金属的常见方法包括原子吸收光谱法(AAS)[1]、电感耦合等离子体法(ICP)[2]、原子荧光光谱法(AFS)[3]、溶出伏安法[4]、高效液相色谱法(HPLC)[5]、分光光度法[6]、酶抑制法[7]、生物化学传感器[8]等，其中AAS、ICP、AFS、HPLC虽然灵敏度高，几乎可以用于所有重金属的检测，但样品前处理和检测过程较复杂，难以实现现场或在线监测，仪器设备的安装环境和使用维护要求较高。

免疫胶体金快速检测法是20世纪90年代兴起的一种新型免疫学检测技术，其反应所需要的原料的全部或大部分均已整合到试剂中，与其他检测方法相比，具有简便、快速、方便等优点。这种检测重金属汞的免疫胶体金层析方法具有较高的灵敏度，适用于大规模样本初筛和现场检测。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

硝酸纤维素膜(NC膜)、玻璃纤维(Millipore公司)；重金属离子(Hg2+、Pb2+、Cr2+、Cu2+、As3+、Cd2+、Mg2+)、氯金酸(HAuCl4·4H2O)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、佐剂(FCA、FICA)、柠檬酸三钠、羊抗鼠IgG、海藻糖、Tween-20(美国Sigma)；异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸(ITCBE日本化学同仁研究所)；聚乙二醇20000、HCl、Na2CO3、NaN3(华东医药有限公司)；PBS溶液、PBST溶液(试验室自配)；包被抗原(Hg-ITCBE-BSA)、免疫抗原(Hg-ITCBE-KLH)[9]、Hg单克隆抗体[10](试验室自制)。

BioJet XYZ3000型点膜仪(美国BioDot)；Avanti J-26XP高速冷冻离心机(美国Becman公司)；恒温鼓风干燥箱(上海精宏实业设备有限公司)；切割机(杭州市恒通设备有限公司)；胶体金读数仪(杭州南开日新生物技术有限公司)；78HW-1恒温磁力搅拌器(杭州仪表电机有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 试纸条和溶液配制

胶体金溶液配制。使用柠檬酸三钠还原氯金酸法制备胶体金[11]。

金标抗体溶液配制。取1 L胶体金溶液使用K2CO3及HCl调整至最适标记pH值后，加入适量Hg2+螯合物单抗，放置12 h后加入5%BSA至BSA最终质量分数为1%，离心纯化后沉淀用0.01 mol·L-1PB溶液(含1%BSA和0.05%NaN3)重悬，4 ℃保存备用。

1.2.2 试纸条组装和样本处理

如图1所示，将稀释好的Hg-ITBCE-BSA和羊抗鼠IgG按一定浓度喷于NC膜上，形成检测线(T线)和质控线(C线)，将金标抗体溶液喷至玻璃纤维上作为金标结合垫，分别置于37 ℃烘箱干燥；将样品垫、金标结合垫、NC膜、吸水垫黏于PVC板上，切成3 mm宽试纸条后，装入塑料模板中压成试剂板。

图1 试纸条的结构

样本处理。取水样(经螯合剂EDTA处理)1 mL于5 mL离心管中，加入3 mL PBST溶液，混匀，待检。本试纸条采用对比法判定，若检测线(T线)显色浅于控制线(C线)显色，则判定为阳性；若检测线(T线)显色深于控制线(C线)显色，或者显色一样深，则判定为阴性；若控制线(C线)没有显色，检测线(T线)无论有无显色，均判定为无效板。

1.2.3 T、C线包被浓度、金标抗体包被量

将抗原Hg-ITCBE-BSA用PBS溶液(含3%甲醇)稀释成0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 mg·mL-1共8个浓度，稀释后按常规喷量1.0 μL·cm-1包被到NC膜上作为T线，保持C线及金标抗体浓度、喷量适量和不变，置于37 ℃干燥箱5 h后组装成试纸条，用0.01 mol·L-1pH 7.4的PBST滴定，观察T线显色强度，读取T/C值。

将羊抗鼠IgG用PBS溶液(含3%甲醇)稀释成0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mg·mL-1，按喷量1.0 μL·cm-1包被到NC膜上作为C线，保持T线及金标抗体浓度、喷量适量和不变，置于37 ℃干燥箱5 h后组装成试纸条，用0.01 mol·L-1pH 7.4的PBST滴定，观察C线显色强度，读取T/C值。

将金标抗体包被到胶体金结合垫上(D525 nm=20，喷量分别为1.5、1.8、2.0、2.2、2.5、2.8、3.0、3.3、3.5 μL·cm-1)，保持T线及C线浓度、喷量适量和不变，置于37 ℃干燥箱5 h后组装成试纸条，用0.01 mol·L-1pH 值7.4的PBST滴定，观察T、C线显色强度，读取T/C值。

1.2.4 检测温度

将所有组分均相同的试纸卡，在4 ℃，15 ℃，20 ℃，25 ℃，37 ℃这5个不同环境温度条件下，用去离子水样和1 μg·L-1Hg2+溶液样本检测，比较显色情况和检测结果差异。

1.2.5 试纸条检测特性

试纸条检出限。取去离子水添加Hg2+至最终质量分数分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 μg·L-1，每个浓度设6个重复，样本处理后滴板检测并记录试验结果。

试纸条特异性。取Hg2+、Pb2+、Cr2+、Cu2+、As3+、Cd2+、Mg2+稀释成梯度浓度后经样本处理，分别使用试纸条检测，记录并比较结果。

试纸条稳定性。将试纸条置于25 ℃下，分别于1、2、3、6、9、12个月后抽取2组，每组3条试纸条，使用去离子水样及1 μg·L-1Hg2+水样检测，观察颜色变化。

2 结果与分析

2.1 T、C线包被浓度、金标抗体包被量

由表1可见，结合T线的显色强度及显色稳定性情况，最终确定抗原的工作浓度范围为0.8～1.2 mg·mL-1。

由表2可见，C线二抗的工作浓度范围为0.8～1.2 mg·mL-1。

由表3可见，结合C/T线显色深浅和灵敏度高低，金标抗体的适宜包被量范围为2.0～3.0 μL·cm-1。

表1 抗原工作浓度范围

表2 羊抗鼠IgG工作浓度范围

表3 金标抗体包被量范围结果

2.2 检测温度

由表4可见，检测温度影响跑板速度，37 ℃相对15～25 ℃平均快6 S，相对4 ℃平均快11.5 S。15～25 ℃下检测，检测结果更准确，4 ℃下检测结果相对偏阳，37 ℃下检测结果相对偏阴。为避免出现假阳性和假阴性结果，保证跑板顺畅，建议检测时采用的环境温度为15～25 ℃。

表4 不同检测温度对检测结果的影响

2.3 试纸条检出限

用试纸条对Hg2+的质量分数分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 μg·L-1进行检测，结果当Hg2+≥1 μg·L-1时，试纸条呈阳性，当Hg2+<1 μg·L-1时，试纸条呈阴性，故试纸条的检出限为1 μg·L-1。

2.4 特异性试验

由表5可知，本试纸条中与常见重金属Pb2+、Cr2+、Cu2+、As3+、Cd2+、Mg2+在100 μg·L-1浓度下无交叉反应，故特异性较高。

表5 试纸条特异性试验结果

2.5 稳定性

由表6可知，25 ℃下试纸条的阴性及检出限浓度下的检测结果在12个月内保持不变，故其在25 ℃下至少可保存12个月。

表6 稳定性试验结果

3 小结

使用胶体金免疫层析技术建立了一种快速检测重金属Hg2+的方法，试纸条对水中Hg2+的检出限可达1 μg·L-1，满足我国相关法规的要求。该方法前处理方法简单，特异性强，可目测直接读取试验结果，检测过程只需3～5 min，可用于水中重金属Hg2+的快速筛查，但阳性结果仍需其他方法确证。

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(责任编辑：张瑞麟)

2017-03-23

绍兴市公益性技术应用研究计划项目(2014B70047)

王 森(1982—)，男，浙江新昌人，农艺师，硕士，从事农产品质量检测工作，E-mail: 47419714@qq.com。

胡叶军，E-mail: hyj664@163.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170635

S158

B

0528-9017(2017)06-1020-04

文献著录格式：王森，叶国华，陈笑笑，等. 胶体金免疫层析法对重金属汞残留的快速检测[J].浙江农业科学，2017，58(6)：1020-1023.