miRNA-210在痴呆中的调控作用及机制

2017-07-25 10:33黄菁菁燕兰云余真冯美江鲁翔
川北医学院学报 2017年3期
关键词:南京医科大学血管性功能障碍

黄菁菁,燕兰云,余真,冯美江,鲁翔

(1.南京医科大学第二附属医院老年科,江苏 南京 210011;2.南京医科大学第一附属医院神经内科,江苏 南京 210029; 3.南京医科大学附属逸夫医院老年科,江苏 南京 211166)

miRNA-210在痴呆中的调控作用及机制

黄菁菁1,燕兰云2,余真1,冯美江1,鲁翔3

(1.南京医科大学第二附属医院老年科,江苏 南京 210011;2.南京医科大学第一附属医院神经内科,江苏 南京 210029; 3.南京医科大学附属逸夫医院老年科,江苏 南京 211166)

目的:观察miRNA-210在痴呆或严重认知功能障碍老年患者血浆中的表达变化,探讨miRNA-210对老年痴呆患者的临床意义。方法:利用miRNA芯片检测老年患者(有无痴呆或严重认知功能障碍)血浆中miRNA-210水平变化。结果:痴呆或严重认知功能障碍的老年患者血浆中miRNA-210的表达水平明显高于无痴呆或严重认知功能障碍的老年患者。结论:miRNA-210在痴呆或严重认知功能障碍的发生发展过程中可能起着重要调控作用,可进一步深入研究其内在机制。

痴呆;严重认知功能障碍;miRNA

近些年来随着人口老龄化的加剧,老年痴呆的发病率逐年递增[1]。该病起病隐袭,进展缓慢,早期症状轻微,且缺乏相关诊断标志物。其中血管性痴呆占老年痴呆的80%以上,与脑组织的缺血缺氧密切相关。而随着对于miRNA的研究越来越深入,我们发现miRNA参与调节了生长发育、细胞增殖、分化、信号通路、新陈代谢和凋亡[2],其中miR-210与缺血性卒中的关系也逐渐明朗。本项研究旨在研究miRNA-210在痴呆或严重认知功能障碍老年患者血浆中的表达变化,为研究老年痴呆的分子调控机制提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 实验组 选取2015年1月至2015年12月期间在我院老年专科门诊诊断(诊断标准参照2011年中国痴呆与认知障碍诊治指南[3])为痴呆或严重认知功能障碍的65岁以上男性45例。入选时符合纳入实验组要求。中途退出实验3例,最终完成实验人数42例。年龄65~96岁,平均年龄(83.2±7.9) 岁。随访2年,每年收集1次实验组血浆(分别为实验组1年和实验组2年),所有标本-80 ℃保存。研究对象均了解和同意该项研究并签署同意书。

1.1.2 对照组 选取2015年1月至2015年12月期间在本院老年专科门诊就诊,排除痴呆或严重认知功能障碍诊断的65岁以上男性45例。入选时符合纳入对照组要求。中途退出实验1例,最终完成实验人数44例。年龄66~92岁,平均年龄(78.8±8.2) 岁。随访2年,收集1次对照组血浆,所有标本-80 ℃保存。研究对象均了解和同意该项研究并签署同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 一般资料 包括姓名、年龄、婚姻状况、教育年数、既往史、家族史、MR检查。排除标准:(1)大血管性梗塞或脑出血,短暂性脑缺血发作病史;(2)帕金森病等神经变性或退行性疾病;(3)其他可能影响认知的神经系统疾病、肿瘤等; (4)听力严重下降影响交流或认知测试; (5)不能接受磁共振成像检查。

1.2.2 认知功能测试 主要包括评价总体认知水平的简易智能量表(mini-mental state examination,MMSE) 。≥25分为认知正常;14~24分为轻度认知功能障碍;≤13分为痴呆或严重认知功能障碍。

1.2.3 实验方法 (1)主要仪器:美国ABI ViiA7实时定量PCR仪。(2)主要试剂:miRNA提取分离试剂盒来自GeneMark公司。反转录试剂盒、用于荧光定量聚合酶链反应(real time polymerase chain reaction,RT-PCR)的SYBR试剂源自TaKaRa公司;miR-210、U6的反转录和PCR引物由上海生工生物有限公司提供。(3)总RNA提取 按miRcute miRNA提取分离试剂说明书抽提样品总RNA。(4)总RNA纯度和浓度检测 纯度检测:用RNase-free水将分光光度计调零,取待测总RNA,测定其A260与A280的OD值。重复3次,求平均值,取A260/A280=1.8~2.1的样本用于下一步实验。浓度测定:操作同上,取三次平均值。加入适量RNase-free水调整浓度至0.1μg /μL。样品RNA浓度计算公式为:OD260×40×稀释倍数(μg /μL)。(5)逆转录反应和荧光定量PCR 用AMV逆转录酶和与其互补的反义引物逆转录成cDNA。再取2 μg cDNA加入20 μL Real-time PCR体系,扩增条件为:95 ℃预变性15 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,测定荧光强度,重复40个循环;72 ℃延伸7 min。使用U6为实验内参。miR-210 Forward Primer:5’-ACACTCCAGCTGG

GCUGUGCGUGUGACAGC-3’,Reverse Primer:5’-CT

CAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTC

AGCCGC-3’,U6 Forward Primer:5’-CTCGCTTCGGC

AGCACA-3’,Reverse Primer:5’-AACGCTTCACGAA

TTTGCGT-3’。

1.3 数据分析

数据采用2-△△CT法进行分析。变化倍数>2为高表达,<0.5为低表达。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 两组患者的临床资料比较

符合标准的入组患者共90例,实验过程中出现排除标准中的疾病,大血管性梗塞患者1例,确诊肿瘤患者1例、失去联系患者1例,死亡患者1例,共排除4例,最终分析病例为86例。从病例资料入选时的一般特点可见,年龄、腔隙性梗死与痴呆或严重认知功能下降有关,组间比较差异有统计学意义(P<0.05) ,见表1。

表1 两组患者的基本临床资料比较

*P<0.05,对照组与实验组比较。

2.2 miR-210的表达

对照组、实验组1年和实验组2年中miR-210的表达水平分别为:0.98±0.10、2.44±0.15和2.54±0.09。与对照组相比,实验组1年和实验组2年miR-210的表达显著升高(P<0.05),两组实验组之间则无明显差异(P>0.05)。说明有痴呆或严重认知功能障碍的老年患者血浆中miRNA-210的表达水平明显高于无痴呆或严重认知功能障碍的老年患者。见图1。

3 讨论

痴呆现已发展为老年医学科临床常见疾病之一,其中血管性痴呆和阿尔兹海默病最为常见,临床上以记忆力下降,执行力、注意力、精神反应速度损害为特点,严重影响了患者的生活质量[4],故该疾病的诊治是医学领域目前相当热门的话题。

传统的神经病学认为阿尔兹海默病的发病机制与血管性痴呆绝对不同,阿尔兹海默病为神经变性病,故该病的诊断将血管因素绝对排除在外[5]。但近些年来的研究发现这两类痴呆均存在低灌注状态,与皮质下缺血缺氧息息相关[6],其中阿尔兹海默病患者可能是由于血流动力学的改变,促进了神经纤维缠结和老年斑形成。而这两类痴呆患者均由于脑动脉血流量减少或中断,导致局部脑组织长期缺血、缺氧,从而引起了相应神经功能的缺损[7-8]。miR-210就是一种在缺氧状态下,由HIF-1α(hypoxia induced factor 1α)诱导产生的miRNA[9]。在缺血的脑皮质中miR-210表达明显上调,通过激活Notch1 信号通路,调节缺血后的血管再生[10]。由于miR-210在血浆和脑脊液中可以直接检测到,并且其含量与大脑中miR-210含量成正比,这就方便我们通过监测外周血中miR-210的含量间接了解大脑中miR-210的含量[11]。这不同于其他标志物,miR-210可以反应分子水平的变化,帮助我们研究疾病的机制[12]。从本研究结果发现,有痴呆或严重认知功能障碍的老年患者血浆中miRNA-210的表达水平明显高于无痴呆的老年患者。但随着脑损伤的进一步加重,脑组织在长期的皮质下缺血缺氧的过程中产生的miR-210可能达到相对稳态,所以对于已经确诊的痴呆患者的miR-210并没有随着时间的推移快速增长。在今后的研究中,可以以不同时间节点和痴呆严重程度对miR-210进行监测。另由于对照组2年miR-210采集数量不足,故仅以1年抽取的数值作为对照,结合实验1年和2年miR-210的结果,我们推测对照组1年与2年miR-210的数值可能也无明显差异。该推论可在今后的研究中再行证实。

我国既是人口大国,同时也进入了老龄化快速发展期,我国老年痴呆的患病人数也将迅速增加,预计到2040年,我国老年痴呆患者人数将是所有发达国家痴呆患者的总和。对于痴呆的精准诊断和有效治疗的研究就刻不容缓,本研究发现miRNA-210在痴呆或严重认知功能障碍的发生发展过程中可能起着重要调控作用,可进一步深入研究其内在机制。

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(学术编辑:张小东)

本刊网址:http://www.nsmc.edu.cn

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邮箱:xuebao@nsmc.edu.cn

Effects and mechanism of miRNA-210 in plasma of elderly patients with dementia

HUANG Jing-jing1,YAN Lan-yun2,YU Zhen1,FENG Mei-jiang1,LU Xiang3

(1.DepartmentofGeriatrics,TheSecondAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210011;2.DepartmentofNeurology,TheFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversityNanjing210029;3.DepartmentofGeriatrics,SirRunRunHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing211166,Jiangsu,China)

Objective:Investigate the expression change of miRNA-210 in the plasma of elderly patients with dementia or severe cognitive impairment,and explore the clinical significance of miRNA-210.Methods:MiRNA-chips were used to detect changes in plasma miRNA-210 levels in elderly patients (with or without dementia or severe cognitive impairment).Results:The expression of miRNA-210 in the plasma of elderly patients with dementia or severe cognitive impairment was significantly higher than that in elderly patients without dementia or severe cognitive impairment.Conclusion:MiRNA-210 may play an important regulatory role in the development of dementia or severe cognitive impairment,and further study its intrinsic mechanism.

Dementia;Severe cognitive impairment;miRNA

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.03.010

南京医科大学科技发展基金重点资助项目(2015NJMUZD036)

2017-04-14

黄菁菁(1983-),女,博士,主治医师,讲师。E-mail:jingjinghuang@njmu.edu.cn

鲁翔,E-mail:luxiang66@njmu.edu.cn

时间:2017-6-21 18∶09 网络出版地址:http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170621.1809.020.html

1005-3697(2017)03-0352-03

R749.16

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