OAZ1基因稳定表达SCC15细胞株的构建及其对舌鳞状细胞癌上皮间质化的影响

王星，姜立，张沄，陈肖燕

(1.西南医科大学附属医院炎症与变态反应实验室，四川泸州646000；2.广东省人民医院医学研究中心，广东广州510080)

OAZ1基因稳定表达SCC15细胞株的构建及其对舌鳞状细胞癌上皮间质化的影响

王星1，姜立2，张沄1，陈肖燕2

(1.西南医科大学附属医院炎症与变态反应实验室，四川泸州646000；2.广东省人民医院医学研究中心，广东广州510080)

目的探索鸟氨酸脱羧酶抗酶(OAZ1)对舌鳞癌细胞株SCC15上皮间质化的影响及相关机制。方法构建框移位点突变的OAZ1过表达慢病毒表达载体pLVX-Neo-OAZ1-IRES-ZsGreen，包装病毒并感染SCC15细胞，采用有限稀释法挑取荧光强度较高的单克隆细胞株；利用RT-PCR和Western blot检测OAZ1以及上皮间质化相关基因(E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Zeb1、Snail、Tw ist1、TGF-β1、Smad1)的mRNA水平和蛋白水平。结果成功构建了OAZ1基因稳定表达的SCC15细胞株，且OAZ1的过表达可以抑制Vimentin、N-cadherin、TGF-β1的mRNA和蛋白水平表达；此外，OAZ1可以促进Smad1的蛋白水平降低。结论OAZ1可以抑制舌鳞癌细胞的上皮间质化，其机制可能涉及TGF-β1信号通路和Smad1信号通路的抑制。

鸟氨酸脱羧酶抗酶；舌磷状细胞癌；慢病毒；上皮间质化

鸟氨酸脱羧酶抗酶(OAZ1)最早发现其可与鸟氨酸脱羧酶(ODC)结合，并靶向使之被26S蛋白酶体降解，从而减少细胞内多胺的水平，影响基因的复制、转录以及细胞的增殖[1]。更多研究表明，作为抑癌基因，OAZ1的功能具有多样性，其不仅可通过诱导CyclinD1、Mps1的非泛素化降解影响细胞增殖以及细胞的遗传稳定性[2-3]；此外，OAZ1还具有诱导细胞分化与凋亡的作用[4-5]。

舌鳞状细胞癌(TSCC)是口腔癌中最常见的恶性肿瘤，一般恶性程度高，生长快，浸润性强，转移早，预后差，复发率高[6]。近年的统计资料显示，舌鳞状细胞癌的发病率呈现明显上升的趋势，并且有发病低龄化的倾向[7]。上皮间质化(EMT)是指上皮细胞经转分化(即由高分化状态向低分化状态转化)变为具有间质细胞表型的生物学现象，其不仅可使肿瘤细胞获得迁移和侵袭特征，还可使肿瘤细胞获得干细胞特性[8]。EMT是上皮来源的舌鳞状细胞癌发生转移的关键启动步骤，参与舌鳞状细胞癌侵袭转移[9]。大量研究表明，高分化舌鳞状细胞癌的预后较低分化鳞状细胞癌更好[10]，且在多种舌鳞癌细胞系中，OAZ1的表达水平降低[11]。进一步研究表明，在舌鳞癌细胞中异位表达外源OAZ1可诱导细胞分化[12]。然而，OAZ1是否可以通过诱导舌鳞癌细胞分化抑制EMT尚不明确。本研究应用慢病毒将OAZ1框移位点突变基因导入SCC15细胞，获得OAZ1基因稳定表达的SCC15细胞株，并进一步探索OAZ1对EMT的影响。

1 材料与方法

1.1 材料DMEM/F12培养基；胎牛血清(Gibco,USA)；Lentivirus质粒系统由深圳百恩微生物公司提供；限制性内切酶Eco RⅠ、XbaⅠ，T4DNA Ligase购自美国NEB公司；OAZ1,Vimentin,N-cadherin抗体购至abcam公司；TGF-β1，Smad1抗体购至Santa Crus公司；G418为Merck公司产品；PrimeScript RT试剂盒、SYBR Premix E×Taq、RNAisoPlus、RNA free dd H2O购自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒表达载体的构建本实验选择含有OAZ1基因框移位点缺失突变的质粒pET-32a-OAZ1 (前期已经构建完成)作为模板，PCR扩增OAZ1框移位点缺失突变基因(687 bp，205位的T缺失)，并且在片段两端分别引入Eco RⅠ和XbaⅠ酶切位点。pLVX-Neo-IRES-ZsGreen载体与扩增的缺失突变基因产物经Eco RⅠ和XbaⅠ双酶切并连接，连接产物pLVX-Neo-OAZ1-IRES-ZsGreen转化JM 109感受态细胞，扩大培养后抽提质粒，酶切测序鉴定。

1.2.2 慢病毒包装利用磷酸钙沉淀法将四质粒系统共转染293T细胞，24 h后更换新鲜培养基，当细胞荧光强度达最强时，收集含病毒的培养基上清，0.22 μm针头滤器过滤获得OAZ1慢病毒，分装后置于-80℃冰箱保存备用。

1.2.3 细胞培养与稳转株的筛选SCC15细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12(100 μg/m L链霉素、100 IU/m L青霉素)，于37℃、5%CO2培养箱中培养。细胞按1×105/孔接种于六孔板，用OAZ1慢病毒和作为对照的GFP慢病毒感染SCC15细胞，共培养24 h后换液继续培养。细胞出现绿色荧光后，用G418 (1 000 μg/m L)进行筛选，扩大培养后使用有限稀释法挑取带绿色荧光的单克隆细胞。

1.2.4 定量PCR检测OAZ1、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Zeb1、Snail、Tw ist1、TGF-β1的mRNA水平按RNAiso Plus试剂盒操作说明提取细胞总RNA。使用PrimeScript RT试剂盒将RNA逆转录成cDNA，Real-time RT-PCR体系10 μL，采用两步法PCR扩增程序：95℃预变性30 s；95℃15 s，58℃45 s，40个PCR循环；55℃～95℃，0.5℃/s变温速度读取熔解曲线。引物序列见表1。

基因名称OAZ1(NM_004152)引物-F -R -F -R -F -R -F -R -F -R -F -R -F -R -F -R -F -R引物序列(5'-3') TCTCCCTCCACTGCTGTAGTAACC GTTGAGAATCCTCGTCTTGTCGTT CTACAATGCCGCCATCGCTTA CACTGATGACTCCTGTGTTCCTGTT TATGAAGGAGGAAATGGCT AGTTTGGAAGAGGCAGAGA GGTAATCCTCCCAAATCAA GGTAATCCTCCCAAATCAA AAGTGGCGGTAGATGGTAA TTGTTGTATGGGTGAAGCA CGAGTGGTTCTTCTGCGCTA CTGCTGGAAGGTAAACTCTGGA GCCGGAGACCTAGATGTCATT CCCACGCCCTGTTTCTTTGA GACAGCAGGGATAACACACT ATGAGAAGCAGGAAAGGC CGCTGAGTACGTCGTGGAGTC GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC引物长度(bp) 198 E-cadherin(NM_001317184.1)98 Vimentin(NM_003380.3)140 N-cadherin(NM_001308176.1)175 Zeb1(NM_001128128.2)104 Snail(NM_005985.3)157 Tw ist1(NM_000474.3)151 TGF-β1(NM_000660.5)107 GAPDH(NM_002046)172

1.2.5 Western blot使用预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗细胞三次，加入裂解液(含PMSF)提取的细胞总蛋白。用12%的分离胶进行SDS-PAGE凝胶电泳，电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉于室温封闭2 h，一抗4℃孵育过夜。二抗4℃孵育2 h，ECL法显影，应用FluorChem 8900软件进行扫描灰度分析。

1.3 统计学方法应用SPSS16.0软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差()表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 构建慢病毒表达载体pLVX-Neo-OAZ1-IRES -ZsGreen以pET-32a-OAZ1质粒为模板，PCR扩增OAZ1框移位点缺失突变基因(687 bp,205位的T缺失)，并且在片段两端分别引入Eco RⅠ和XbaⅠ酶切位点，测序鉴定显示扩增片段准确无误，205位的T已经缺失。测序结果如图1。将扩增得到的OAZ1目的片段连接到pLVX-Neo-IRES-ZsGreen慢病毒表达载体中，连接产物pLVX-Neo-OAZ1-IRES-ZsGreen转化JM 109感受态细胞，扩大培养后抽提质粒，经酶切测序鉴定pLVX-Neo-OAZ1-IRES-ZsGreen重组载体构建成功(图2)。

图1 OAZ1突变基因的测序结果

图2 pLVX-Neo-OAZ1-IRES-ZsGreen双酶切验证

2.2 病毒包装及OAZ1基因稳定表达SCC15细胞株的构建四质粒系统共转染293T细胞，更换新鲜培养基后24 h荧光强度达到最高(图3)，故在此时离心收集含病毒的上清液，过滤获得OAZ1慢病毒。使用获得的慢病毒感染HEK293细胞，更换新鲜培养基后24 h于荧光显微镜下计数荧光细胞数目，生物学滴度测定结果显示，OAZ1病毒为2×107TU/m L(图4)。使用OAZ1慢病毒及GFP慢病毒感染SCC15细胞，然而G418筛选后，SCC15/OAZ1细胞株的荧光率未达到75%以上(图5)。故使用有限稀释法挑取9株荧光强度较高的单克隆细胞进行培养(图6A)。Western blot和定量PCR验证OAZ1的表达情况。结果显示，相对于对照组SCC15细胞和转染空载体的SCC15/GFP细胞，实验组SCC15/OAZ1-1，SCC15/OAZ1-7，SCC15/ OAZ1-8，SCC15/OAZ1-9等4株单克隆细胞中OAZ1的mRNA水平均显著上调(图6B)。进一步Western blot结果显示，SCC15/OAZ1-8细胞中OAZ1蛋白水平上调最为显著(图6C)。故选择SCC15/OAZ1-8细胞用于后续的研究。

图3 四质粒系统转染293T细胞包装病毒(×10)

图4 倍比稀释法测定慢病毒滴度(×10)

图5 OAZ1慢病毒和GFP慢病毒稳定转染SCC15细胞株(×20)

图6 OAZ1稳定转染的单克隆细胞株筛选(×20)

2.3 OAZ1抑制舌鳞癌细胞SCC15的上皮间质化检测EMT相关基因(E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Zeb1、Snail、Twist1、TGF-β1)的mRNA水平，结果显示，在SCC15/OAZ1细胞中，Vimentin，N-cadherin和TGF-β1的mRNA水平显著降低，而E-cadherin、Zeb1、Snail、Twist1的mRNA水平没有明显变化(图7A)。Western blot结果显示，OAZ1的过表达可抑制Vimentin、N-cadherin和TGF-β1的蛋白水平(图7B)，表明OAZ1可以抑制舌鳞癌细胞SCC15的上皮间质化，其机制可能涉及TGF-β1的转录抑制。进一步研究结果显示，相对于对照组SCC15细胞和转染空载体的SCC15/GFP细胞，实验组SCC15/OAZ1中Smad1的蛋白水平显著降低，然而其mRNA水平没有明显变化(图7A，B)。提示，OAZ1可能通过促进Smad1的降解抑制SCC15细胞的上皮间质化。

图7 OAZ1抑制舌鳞癌细胞SCC15的上皮间质化

3 讨论

OAZ1在细胞增殖分化以及凋亡中起重要调控作用，其因在多胺代谢中的重要调控地位以及诱导部分细胞内重要大分子的非泛素依赖降解作用而备受关注[5,13]。现已证实OAZ1作为一个抑癌基因具有抗肿瘤特性[14]。研究显示，在舌鳞癌癌细胞中，OAZ1可以诱导细胞向终末分化，且抑制细胞的增殖[12]。然而，OAZ1是否参与调控舌鳞癌细胞上皮间质化过程尚不明确，故对其进行深入研究，将有助于OAZ1在舌鳞状细胞癌治疗中的研究应用。

为了研究OAZ1对舌鳞癌细胞上皮间质化的影响，本研究利用携带OAZ1框移位点缺失突变的慢病毒构建OAZ1稳定表达的舌鳞癌细胞株SCC15/OAZ1。然而经G418筛选后，SCC15/OAZ1细胞株的荧光率未达到75%以上。为了进一步提高阳性细胞的百分率，我们通过有限稀释法挑取带绿色荧光的单克隆细胞进行培养。经定量PCR和Western blot检测发现，SCC15/OAZ1-8细胞中OAZ1的mRNA水平和蛋白水平均显著高于对照组，表明我们已经成功构建OAZ1稳定表达细胞株。

上皮间质化在舌鳞癌转移中发挥关键作用。E-cadherin是钙粘蛋白超家族成员，可介导细胞间连接，其作为上皮标志物在鳞状细胞癌中表达水平显著下调[15]。然而，定量结果显示在SCC15/OAZ1细胞中E-cadherin的mRNA表达水平没有显著变化。研究表明，在上皮间质化过程中，间质细胞标志物Vimentin、N-cadherin以及EMT相关的转录因子Zeb1、Snail和Tw ist1的表达水平上调[16-17]。我们的研究结果显示，在SCC15/OAZ1细胞中间质细胞标志物Vimentin、N-cadherin的mRNA水平显著降低，然而EMT相关的转录因子Zeb1、Snail和Tw ist1的mRNA水平没有明显变化。进一步的实验表明，在SCC15/OAZ1细胞中Vimentin、N-cadherin蛋白水平显著降低。这些结果表明，在舌鳞癌细胞中OAZ1的过表达可以抑制上皮间质化，然而其机制可能并不涉及调控Zeb1、Snail和Tw ist1等转录因子的表达。

TGF-β1信号通路在促进肿瘤细胞上皮间质化中扮演重要作用，TGF-β1可以通过激活Smad2/3信号通路促进上皮间质化[18]。故我们检测了OAZ1对TGF-β1的影响，结果显示，OAZ1可以抑制TGF-β1的mRNA水平以及蛋白水平。此外，有研究显示，BMPs/Smad1信号通路的激活同样可以促进上皮间质化[19-23]。而OAZ1可与Smad1以及HsN3形成Smad1-HsN3-OAZ1三元复合物，并且介导Smad1的非泛素依赖性降解[24-25]。故我们检测了Smad1的蛋白水平，结果显示OAZ1可以促进Smad1的降解。因此推测，OAZ1可能通过抑制TGF-β1信号通路和Smad1信号通路抑制舌鳞癌细胞的上皮间质化。然而OAZ1抑制舌鳞癌细胞上皮间质化的确切分子机制还需进一步研究。

[1]Kahana C.Antizyme and antizyme inhibitor,a regulatory tango[J]. Cell Mol Life Sci,2009,66(15)：2479-2488.

[2]Newman RM,Mobascher A,Mangold U,et al.Antizyme targets cyclin D1 for degradation.A novel mechanism for cell grow th repression[J].J Biol Chem,2004,279(40)：41504-41511.

[3]Kasbek C,Yang CH,Fisk HA.Antizyme restrains centrosome amplification by regulating the accumulation of Mps1 at centrosomes[J]. Mol Biol Cell,2010,21(22)：3878-3889.

[4]Suzuki J,Murakam i Y,Samejima K,et al.Antizyme is necessary for conversion of pancreatic tumor cells into glucagon-producing differentiated cells[J].Endocr Relat Cancer,2009,16(2)：649-659.

[5]Dulloo I,Gopalan G,Melino G,et al.The antiapoptotic DeltaNp73 is degraded in a c-Jun-dependent manner upon genotoxic stress through the antizyme-mediated pathway[J].Proc Natl Acad Sci USA,2010, 107(11)：4902-4907.

[6]Bagan J,Sarrion G,Jimenez Y.Oral cancer：clinical features[J].Oral Oncol,2010,46(6)：414-417.

[7]Garavello W,Spreafico R,Gaini RM.Oral tongue cancer in young patients：a matched analysis[J].Oral Oncol,2007,43(9)：894-897.

[8]Lamouille S,Xu J,Derynck R.Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2014,15(3)：178-196.

[9]Huang W,Cui X,Chen J,et al.Long non-coding RNA NKILA inhibits migration and invasion of tongue squamous cell carcinoma cells via suppressing epithelial-mesenchymal transition[J].Oncotarget, 2016,7(38)：62520-62532.

[10]Kobayashi H,Sagara J,Kurita H,et al.Clinical significance of cellular distribution of moesin in patients w ith oral squamous cell carcinoma[J].Clin Cancer Res,2004,10(2)：572-580.

[11]Tsuji T,Katsurano M,Ibaragi S,et al.Ornithine decarboxylase antizyme upregulates DNA-dependent protein kinase and enhances the nonhomologous end-joining repair of DNA double-strand breaks in human oral cancer cells[J].Biochem istry,2007,46(31)：8920-8932.

[12]Wang X,Jiang L.Effects of ornithine decarboxylase antizyme 1 on the proliferation and differentiation of human oral cancer cells[J].Int J Mol Med,2014,34(6)：1606-1612.

[13]Tsuji T,Usui S,Aida T,et al.Induction of epithelial differentiation and DNA demethylation in hamster malignant oral keratinocyte by ornithine decarboxylase antizyme[J].Oncogene,2001,20(1)：24-33.

[14]Olsen RR,Zetter BR.Evidence of a role for antizyme and antizyme inhibitor as regulators of human cancer[J].Mol Cancer Res,2011,9 (10)：1285-1293.

[15]Li L,Li C,Wang S,et al.Exosomes derived from hypoxic oral squamous cell carcinoma cells deliver m iR-21 to Normoxic Cells to Elicit a Prometastatic Phenotype[J].Cancer Res,2016,76(7)：1770-1780.

[16]Nieto MA.Epithelial plasticity：a common theme in embryonic and cancer cells[J].Science,2013,342(6159)：1234850.

[17]Yoon NA,Jo HG,Lee UH,et al.Tristetraprolin suppresses the EMT through the down-regulation of Tw ist1 and Snail1 in cancer cells[J]. Oncotarget,2016,7(8)：8931-8943.

[18]Tang YN,Ding WQ,Guo XJ,et al.Epigenetic regulation of Smad2 and Smad3 by profilin-2 promotes lung cancer grow th and metasta-sis[J].Nat Commun,2015,6：8230.

[19]Wang Y,Sun B,Zhao X,et al.Tw ist1-related m iR-26b-5p suppresses epithelial-mesenchymal transition,m igration and invasion by targeting SMAD1 in hepatocellular carcinoma[J].Oncotarget,2016,7 (17)：24383-24401.

[20]Richter A,Valdimarsdottir L,Hrafnkelsdottir HE,et al.BMP4 promotes EMT and mesodermal comm itment in human embryonic stem cells via SLUG and MSX2[J].Stem Cells,2014,32(3)：636-648.

[21]Liang D,Wang Y,Zhu Z,et al.BMP-7 attenuated silica-induced pulmonary fibrosis through modulation of the balance between TGF-β/ Smad and BMP-7/Smad signaling pathway[J].Chem Biol Interact, 2016,243：72-81.

[22]Kim BR,Oh SC,Lee DH,et al.BMP-2 induces motility and invasiveness by promoting colon cancer stemness through STAT3 activation[J].Tumour Biol,2015,36(12)：9475-9486.

[23]Liu CW,Li CH,Peng YJ,et al.Snail regulates Nanog status during the epithelial-mesenchymal transition via the Smad1/Akt/GSK3β signaling pathway in non-small-cell lung cancer[J].Oncotarget,2014,5 (11)：3880-3894.

[24]Lin Y,Martin J,Gruendler C,et al.A novel link between the proteasome pathway and the signal transduction pathway of the bone morphogenetic proteins(BMPs)[J].BMC Cell Biol,2002,3：15.

[25]Gruendler C1,Lin Y,Farley J,et al.Proteasomal degradation of Smad1 induced by bone morphogenetic proteins[J].J Biol Chem, 2001,276(49)：46533-46543.

Establishment of SCC15 cell line stably expressing human OAZ1 gene and its influence on the epithelialmesenchymal transition of tongue squamous cell carcinoma.

WANG Xing1,JIANG Li2,ZHANG Yun1,CHEN Xiao-yan2.1.Laboratory of Inflammation and Allergy,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou 646000,Sichuan,CHINA;2.Medical Research Center,Guangdong General Hospital,Guangzhou 510080,Guangdong, CHINA

Objective To investigate the role of OAZ1 in epithelial mesenchymal transition(EMT)in tongue squamous cell carcinoma cell lines SCC15 and explore its related mechanism.Methods The lentivirus vector pLVX-Neo-OAZ1-IRES-ZsGreen in which the target gene OAZ1 was modified at the frameshift site was constructed, packaged lentivirus and infected SCC15 cells,and the monoclonal cell lines w ith high fluorescence intensity were obtained by lim ited diluted method.Real-time PCR and Western blot was used to detect the expression of OAZ1 and the genes(E-cadherin,Vimentin,N-cadherin,Zeb1,Snail,Tw ist1,TGF-β1,Smad1)related w ith EMT.Results The SCC15 cell line w ith stable expression of OAZ1 gene was successfully constructed.The overexpression of OAZ1 inhibited the protein level and mRNA level of the Vimentin,N-cadherin,TGF-β1.Furthermore,the OAZ1 would promote the degradation of Smad1.Conclusion OAZ1 can inhibit the EMT of tongue squamous cell carcinoma cell lines through the possible mechanism related w ith the inhibition of TGF-β1and Smad1 pathway.

Ornithine decarboxylase antizyme 1(OAZ1);Tongue squamous cell carcinoma(TSCC);Lentivirus;Epithelial mesenchymal transition(EMT)

R739.86

A

1003—6350（2017）13—2065—07

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.13.001

2017-04-14)

国家自然科学基金(编号：30901757)

姜立。E-mail：lijiang3434@yeah.net